Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi
Summary
Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU’yu açıklıyoruz.
Abstract
Bulaşıcı bir ajan tarafından dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olan tüberküloz (TB), 2022’de 1,6 milyon insanı öldürdü, ancak 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı. Hastalığa Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisi neden olur. Tek tüberküloz aşısı olan Mycobacterium bovis suşu Bacillus Calmette-Guérin (BCG), halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır. Şu anda klinik deneylerde 12 aşı ve klinik öncesi geliştirilmekte olan düzinelerce aşı var. Klinik öncesi çalışmalarda TB aşılarının etkinliğini değerlendirmek için kullanılan tercih edilen yöntem, bakteri kolonilerinin koloni oluşturan birimler (CFU) testi ile sayımıdır. Bu zaman alıcı tahlilin sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer, önemli laboratuvar ve inkübatör alanı gerektirir, yüksek reaktif maliyetlerine sahiptir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, M.tb aşısının etkinlik sonuçlarını analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunan, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU’yu (mCFU) açıklıyoruz. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Ayrıca, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için, Mikobakteriler ile enfekte olmuş aşılanmış hayvanlardan alınan dokular da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan örnekler alınabilir. Ayrıca, enfeksiyon çalışmaları için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli bir mikobakteri kültürü üretmek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, bu yöntemlerin aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB’ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz.
Introduction
Tüberküloz (TB), tek bir enfeksiyöz ajan olan Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisinin dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve diğer tüm patojenlerden daha fazla insanı öldürür. 2021’de tüberküloz 1,6 milyon ölümden sorumluydu ve 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı1. Ayrıca, Dünya Sağlık Örgütü’nün 2022 küresel TB raporuna göre, COVID-19 salgını yeni TB vakalarındaki artıştan sorumluydu. DSÖ ayrıca bu dönemde TB teşhisi konan kişi sayısında büyük düşüşler olduğunu ve bunun TB vakalarının sayısını daha da artırabileceğini bildirmektedir1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 100 yıldan daha uzun bir süre önce ilk kez aşı olarak kullanılan patojenik Mycobacterium bovis’in canlı zayıflatılmış bir türüdür. Bu, tüberküloza karşı tek aşıdır ve halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır 2,3. Şu anda, klinik deneylerin farklı aşamalarında12 aşı bulunmaktadır 4 ve düzinelerce aşı klinik öncesi geliştirme aşamasındadır 5,6. Tüberküloza karşı aşıların klinik öncesi değerlendirmesi, zebra balığı, fareler, kobaylar, tavşanlar, sığırlar ve insan olmayan primatlar gibi çeşitli hayvan modellerinde elde edilebilen güvenlik ve immünojenisitenin7 değerlendirilmesini içerir 8,9,10. Ek olarak, bir aşının M.tb enfeksiyonuna ve/veya bulaşmasına karşı koruma sağlama kapasitesinin, yani aşı etkinliğinin değerlendirilmesi, in vivo 5,11. İlginç bir şekilde, BCG aşısı, eğitilmiş bağışıklık mekanizması12,13 yoluyla diğer bakteriyel ve viral patojenlerin14 hayatta kalmasını etkileyen spesifik olmayan etkilere neden olur. Enfekte bir hayvandaki canlı bakteri yükünü ölçmek için tercih edilen yöntem, koloni oluşturan birimler (CFU)testi 5,15 yoluyla bakteri kolonilerinin sayımıdır. CFU, belirli büyüme koşulları altında koloniler oluşturan mikroorganizmaların (bakteri veya mantar) sayısını tahmin eden bir birimdir. CFU’lar canlı ve replikatif mikroorganizmalardan kaynaklanır ve her kolonideki canlı mikroorganizmaların mutlak sayısını tahmin etmek zordur. Bir koloninin bir veya daha fazla mikroorganizmadan kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizdir. CFU birimi bu belirsizliği yansıtır, bu nedenle aynı numunenin kopyalarında büyük bir değişkenlik gözlemlenebilir. Bu zaman alıcı tahlil, bir biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL3) tesisinde, önemli laboratuvar ve inkübatör alanında çalışmak üzere eğitilmiş uzman teknisyenler gerektirir, sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer ve kontaminasyona eğilimlidir.
Bu çalışmada, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU’yu (mCFU) tanımladık vesonuçları analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunuyoruz 15,16,17,18,19,20. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Bu yöntemin, aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB’ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz. Son olarak, bu optimize edilmiş CFU sayım yöntemi, yalnızca Mikobakterileri değil, aynı zamanda Escherichia coli ve Ralstonia solanacearum21 gibi diğer bakterileri de ölçmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüberküloz, özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde önemi giderek artan önemli bir halk sağlığı sorunudur. COVID-19 pandemisi sırasında tüberkülozu teşhis ve tedavi etmek için sağlık hizmeti ortamlarının bozulması, yeni vakaların görülme sıklığı üzerinde olumsuz bir etkiye neden olmuştur1. Ek olarak, bu salgını kontrol etmek için çoklu ilaç ve yaygın ilaca dirençli M.tb suşları ve M.tb ve HIV’in birlikte enfeksiyonu acilen ele alınmal?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Universidade Católica Portuguesa Tıp Fakültesi’nin iç finansmanı ve UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ve EXPL/SAU-INF/0742/2021 hibeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a Tecnologia’nın (FCT) dış finansmanı ile desteklenmiştir.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
