Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis
Summary
La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.
Abstract
La tuberculosis (TB), la principal causa de muerte en todo el mundo por un agente infeccioso, mató a 1,6 millones de personas en 2022, solo superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021. La enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), la única vacuna contra la tuberculosis, es la vacuna autorizada más antigua del mundo, todavía en uso. Actualmente, hay 12 vacunas en ensayos clínicos y docenas de vacunas en desarrollo preclínico. El método de elección utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis en estudios preclínicos es la enumeración de las colonias bacterianas mediante el ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC). Este ensayo, que requiere mucho tiempo, tarda entre 4 y 6 semanas en concluir, requiere un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tiene altos costes de reactivos y es propenso a la contaminación. Aquí describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), que ofrece una solución simple y rápida para analizar los resultados de eficacia de la vacuna M.tb . El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Además, para evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se pueden obtener muestras de diversas fuentes, incluidos tejidos de animales vacunados infectados con micobacterias. También describimos un método optimizado para producir un cultivo de micobacterias unicelular, uniforme y de alta calidad para estudios de infección. Por último, proponemos que estos métodos se adopten universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.
Introduction
La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte en todo el mundo por un solo agente infeccioso, la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), que mata a más personas que cualquier otro patógeno. En 2021, la tuberculosis fue responsable de 1,6 millones de muertes y fue superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-20211. Además, según el informe mundial sobre la tuberculosis de 2022 de la Organización Mundial de la Salud, la pandemia de COVID-19 fue responsable de un aumento de los nuevos casos de tuberculosis. La OMS también informa de grandes descensos en el número de personas diagnosticadas con tuberculosis durante este período, lo que podría aumentar aún más el número de casos de tuberculosis1.
El Bacillus Calmette-Guérin (BCG) es una cepa viva atenuada de la patógena Mycobacterium bovis, utilizada por primera vez como vacuna hace más de 100 años. Esta es la única vacuna contra la tuberculosis y es la vacuna autorizada más antigua en el mundo que aún se utiliza 2,3. Actualmente, hay 12 vacunas en diferentes fases de ensayos clínicos4, y decenas de vacunas están en desarrollo preclínico 5,6. La evaluación preclínica de las vacunas contra la TB incluye la evaluación de la seguridad e inmunogenicidad7, que se puede obtener en diversos modelos animales como pez cebra, ratones, cobayas, conejos, bovinos y primates no humanos 8,9,10. Además, la evaluación de la capacidad de una vacuna para inducir protección contra la infección y/o transmisión por M.tb, es decir, la eficacia de la vacuna, requiere un desafío con M.tb in vivo 5,11. Curiosamente, la vacunación con BCG induce efectos inespecíficos que afectan la supervivencia de otros patógenos bacterianos y virales12,13 a través del mecanismo de inmunidad entrenada14. Para cuantificar la carga bacteriana viable en un animal infectado, el método de elección es la enumeración de colonias bacterianas a través del ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC) 5,15. La UFC es una unidad que estima el número de microorganismos (bacterias u hongos) que forman colonias en condiciones específicas de crecimiento. Las UFC se originan a partir de microorganismos viables y replicativos, y el número absoluto de microorganismos vivos dentro de cada colonia es difícil de estimar. No se sabe con certeza si una colonia se ha originado a partir de uno o más microorganismos. La unidad UFC refleja esta incertidumbre, por lo que se puede observar una gran variabilidad en las réplicas de una misma muestra. Este ensayo, que requiere mucho tiempo, requiere técnicos especializados capacitados para trabajar en una instalación de nivel de bioseguridad 3 (BSL3), un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tarda de 4 a 6 semanas en concluir y es propenso a la contaminación.
En este estudio, describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), y ofrecemos una solución simple y rápida para analizar los resultados 15,16,17,18,19,20. El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Proponemos que este método se adopte universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis. Finalmente, este método optimizado de enumeración de UFC se ha utilizado para cuantificar no solo micobacterias sino también otras bacterias, como Escherichia coli y Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tuberculosis es un importante problema de salud pública con una importancia creciente, especialmente en los países de ingresos bajos y medios. La interrupción de los entornos sanitarios para diagnosticar y tratar la tuberculosis durante la pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en la incidencia de nuevos casos1. Además, las cepas de M.tb multirresistentes y ampliamente resistentes, así como la coinfección de M.tb y VIH, deben abordarse con urgencia para controlar …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de financiación interna de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica Portuguesa y de la Fundación para la Ciencia y Tecnología (FCT), en el marco de las subvenciones UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 y EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
