Анализ микроколониеобразующих единиц для оценки эффективности вакцин против туберкулеза
Summary
Определение колониеобразующих единиц (КОЕ) является золотым стандартом для количественного определения бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis , для формирования видимых колоний которых могут потребоваться недели. В этой статье мы опишем микро-КОЕ для определения КОЕ с повышенной эффективностью по времени, уменьшенным пространством лаборатории и стоимостью реагентов, а также масштабируемостью для экспериментов со средней и высокой пропускной способностью.
Abstract
В 2022 г. от туберкулеза (ТБ), основной причины смерти от инфекционного агента во всем мире, умерло 1,6 миллиона человек, уступив только COVID-19 во время пандемии 2019-2021 гг. Заболевание вызывается бактерией Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), единственная противотуберкулезная вакцина, является старейшей лицензированной вакциной в мире, которая используется до сих пор. В настоящее время 12 вакцин проходят клинические испытания и десятки вакцин находятся на стадии доклинической разработки. Методом выбора для оценки эффективности противотуберкулезных вакцин в доклинических исследованиях является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот трудоемкий анализ занимает от 4 до 6 недель, требует значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, имеет высокую стоимость реагентов и подвержен загрязнению. В этой статье мы опишем оптимизированный метод переписи колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), который предлагает простое и быстрое решение для анализа результатов анализа эффективности вакцины против туберкулеза . Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Кроме того, для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины могут быть получены образцы из различных источников, включая ткани вакцинированных животных, инфицированных микобактериями. Описан оптимизированный метод получения одноклеточной, однородной и высококачественной культуры микобактерий для изучения инфекций. Наконец, мы предлагаем повсеместно использовать эти методы для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза.
Introduction
Туберкулез (ТБ) является основной причиной смерти во всем мире от одного инфекционного агента, бактерии Mycobacterium tuberculosis (M.tb), убивающей больше людей, чем любой другой патоген. В 2021 г. туберкулез стал причиной 1,6 миллиона случаев смерти, а вовремя пандемии 2019–2021 гг. его превзошел COVID-191. Более того, согласно глобальному докладу Всемирной организации здравоохранения о туберкулезе за 2022 год, пандемия COVID-19 привела к росту числа новых случаев заболевания туберкулезом. ВОЗ также сообщает о значительном снижении числа людей, у которых диагностирован туберкулез в течение этого периода, что может привести к дальнейшему увеличению числа случаев заболеваниятуберкулезом1.
Бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ) — живой аттенуированный штамм патогенной Mycobacterium bovis, впервые использованный в качестве вакцины более 100 лет назад. Это единственная вакцина против туберкулеза и самая старая лицензированная вакцина в мире, используемаядо сих пор. В настоящее время на разных фазах клинических испытаний находятся 12 вакцин4, а на стадии доклинической разработки находятся десятки вакцин 5,6. Доклиническая оценка вакцин против туберкулеза включает оценку безопасности и иммуногенности7, которые могут быть получены на различных моделях животных, таких как рыбки данио, мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот и приматы 8,9,10. Кроме того, для оценки способности вакцины индуцировать защиту от инфекции и/или передачи МТБ, т.е. эффективности вакцины, необходимо провести тест на МТБ in vivo 5,11. Интересно, что вакцинация БЦЖ индуцирует неспецифические эффекты, которые влияют на выживаемость других бактериальных и вирусных патогенов12,13 через механизм обученного иммунитета14. Для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки у инфицированного животного методом выбора является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ) 5,15. КОЕ — это единица, которая оценивает количество микроорганизмов (бактерий или грибов), которые образуют колонии при определенных условиях роста. КОЕ происходят от жизнеспособных и репликативных микроорганизмов, и абсолютное количество живых микроорганизмов в каждой колонии трудно оценить. Неясно, произошла ли колония от одного или нескольких микроорганизмов. Единица КОЕ отражает эту неопределенность, поэтому в репликах одного и того же образца можно наблюдать большую вариабельность. Этот трудоемкий анализ требует специализированных технических специалистов, обученных работе на объекте уровня биобезопасности 3 (BSL3), значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, занимает от 4 до 6 недель и подвержен загрязнению.
В этом исследовании мы описываем оптимизированный метод пересчета колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), и предлагаем простое и быстрое решение для анализа результатов 15,16,17,18,19,20. Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Мы полагаем, что этот метод должен быть повсеместно принят для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза. Наконец, этот оптимизированный метод подсчета КОЕ был использован для количественного определения не только микобактерий, но и других бактерий, таких как Escherichia coli и Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Туберкулез является серьезной проблемой общественного здравоохранения, приобретающей все большее значение, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. Перебои в работе медицинских учреждений по диагностике и лечению туберкулеза во время пандемии COVID-19 оказали негативное вл…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана внутренним финансированием медицинского факультета Португальского католического университета и внешним финансированием Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) в рамках грантов UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 и EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
