Analyse av mikrokolonidannende enhet for effektevaluering av vaksiner mot tuberkulose
Summary
Bestemmelse av kolonidannende enheter (CFU) er gullstandardteknikken for å kvantifisere bakterier, inkludert Mycobacterium tuberculosis som kan ta uker å danne synlige kolonier. Her beskriver vi en mikro-CFU for CFU-bestemmelse med økt tidseffektivitet, redusert laboratorieplass og reagenskostnader, og skalerbarhet til middels og høy gjennomstrømningseksperimenter.
Abstract
Tuberkulose (TB), den ledende dødsårsaken over hele verden av et smittsomt agens, drepte 1,6 millioner mennesker i 2022, og ble bare overgått av Covid-19 under pandemien 2019-2021. Sykdommen forårsakes av bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), den eneste TB-vaksinen, er den eldste lisensierte vaksinen i verden, fortsatt i bruk. For tiden er det 12 vaksiner i kliniske studier og dusinvis av vaksiner under preklinisk utvikling. Den valgte metoden som brukes til å vurdere effekten av TB-vaksiner i prekliniske studier, er oppregningen av bakteriekolonier ved CFU-analysen (kolonidannende enheter). Denne tidkrevende analysen tar 4 til 6 uker å konkludere, krever betydelig laboratorie- og inkubatorplass, har høye reagenskostnader og er utsatt for forurensning. Her beskriver vi en optimalisert metode for kolonioppregning, mikro-CFU (mCFU), som tilbyr en enkel og rask løsning for å analysere M.tb-vaksineeffektresultater . mCFU-analysen krever ti ganger færre reagenser, reduserer inkubasjonsperioden tre ganger, tar 1 til 2 uker å konkludere, reduserer laboratorieplass og reagenskostnader, og minimerer helse- og sikkerhetsrisikoen forbundet med å jobbe med et stort antall M.tb. Videre, for å evaluere effekten av en TB-vaksine, kan prøver fås fra en rekke kilder, inkludert vev fra vaksinerte dyr infisert med mykobakterier. Vi beskriver også en optimalisert metode for å produsere en encellet, ensartet mykobakteriekultur av høy kvalitet for infeksjonsstudier. Til slutt foreslår vi at disse metodene skal være universelt vedtatt for prekliniske studier av vaksineeffektbestemmelse, noe som til slutt fører til tidsreduksjon i utviklingen av vaksiner mot TB.
Introduction
Tuberkulose (TB) er den ledende dødsårsaken over hele verden av et enkelt smittsomt middel, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), som dreper flere mennesker enn noe annet patogen. I 2021 var tuberkulose ansvarlig for 1,6 millioner dødsfall og ble forbigått av COVID-19 under pandemien 2019-20211. Dessuten, ifølge Verdens helseorganisasjons globale TB-rapport fra 2022, var COVID-19-pandemien ansvarlig for en økning i nye TB-tilfeller. WHO rapporterer også store dråper i antall personer diagnostisert med TB i denne perioden, noe som kan øke ytterligere antall TB-tilfeller1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er en levende-svekket stamme av den patogene Mycobacterium bovis, brukt for første gang som en vaksine for mer enn 100 år siden. Dette er den eneste vaksinen mot tuberkulose og er den eldste lisensierte vaksinen i verden som fortsatt er i bruk 2,3. For tiden er det 12 vaksiner i ulike faser av kliniske studier4, og dusinvis av vaksiner er under preklinisk utvikling 5,6. Preklinisk vurdering av vaksiner mot tuberkulose inkluderer evaluering av sikkerhet og immunogenitet7, som kan fås i ulike dyremodeller som sebrafisk, mus, marsvin, kaniner, storfe og ikke-menneskelige primater 8,9,10. I tillegg krever vurdering av en vaksines kapasitet til å indusere beskyttelse mot M.tb-infeksjon og / eller overføring, dvs. vaksineeffektiviteten, en M.tb-utfordring in vivo 5,11. Interessant nok induserer BCG-vaksinasjon ikke-spesifikke effekter som påvirker overlevelsen av andre bakterielle og virale patogener12,13 gjennom mekanismen for trent immunitet14. For å kvantifisere den levedyktige bakteriebyrden i et infisert dyr, er den valgte metoden oppregningen av bakteriekoloniergjennom CFU-analysen (kolonidannende enheter) 5,15. CFU er en enhet som estimerer antall mikroorganismer (bakterier eller sopp) som danner kolonier under spesifikke vekstforhold. CFU stammer fra levedyktige og replikerende mikroorganismer, og det absolutte antall levende mikroorganismer i hver koloni er vanskelig å anslå. Det er usikkert om en koloni har sitt utspring fra en eller flere mikroorganismer. CFU-enheten reflekterer denne usikkerheten, og det kan derfor observeres stor variasjon i replikater av samme utvalg. Denne tidkrevende analysen krever spesialiserte teknikere opplært til å jobbe i et biosikkerhetsnivå 3 (BSL3) anlegg, betydelig laboratorie- og inkubatorplass, tar fra 4 til 6 uker å konkludere, og er utsatt for forurensning.
I denne studien beskriver vi en optimalisert metode for kolonioppregning, mikro-CFU (mCFU), og tilbyr en enkel og rask løsning for å analysere resultatene 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen krever ti ganger færre reagenser, reduserer inkubasjonsperioden tre ganger, tar 1 til 2 uker å konkludere, reduserer laboratorieplass og reagenskostnader, og minimerer helse- og sikkerhetsrisikoen forbundet med å jobbe med et stort antall M.tb. Vi foreslår at denne metoden skal være universelt vedtatt for prekliniske studier av vaksineeffektbestemmelse, noe som til slutt fører til tidsreduksjon i utviklingen av vaksiner mot TB. Endelig har denne optimaliserte metoden for CFU-oppregning blitt brukt til å kvantifisere ikke bare mykobakterier, men også andre bakterier, som Escherichia coli og Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tuberkulose er et viktig folkehelseproblem med økende betydning, særlig i lav- og mellominntektsland. Forstyrrelsen av helsetjenester for å diagnostisere og behandle TB under COVID-19-pandemien forårsaket en negativ innvirkning på forekomsten av nye tilfeller1. I tillegg må de multi-stoff- og omfattende stoffresistente M.tb-stammene, og co-infeksjonen av M.tb og HIV snarest adresseres for å kontrollere denne epidemien 1,34<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av intern finansiering fra Det medisinske fakultet, Universidade Católica Portuguesa, og ekstern finansiering fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), under tilskuddene UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020, og EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
