Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën
Summary
We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.
Abstract
Een belangrijke gebeurtenis bij bacteriële celdeling is het septatieproces, waarbij het eiwit FtsZ het belangrijkste element is. FtsZ polymeriseert en vormt een ringachtige structuur (Z-ring) in het midden van de cel die dient als steiger voor andere delingseiwitten. Superresolutiemicroscopie in bacteriële modellen Escherichia coli en Bacillus subtilis toonden aan dat de Z-ring discontinu is, terwijl live cell imaging-studies aantoonden dat FtsZ langs de ring beweegt door een mechanisme dat bekend staat als loopband. Om de dynamica van FtsZ in vivo te bestuderen, is een speciale celplaatsing in een verticale positie nodig om de volledige structuur van de ring in het XY-vlak in beeld te brengen. In het geval van FtsZ-beeldvorming in meercellige cyanobacteriën, zoals Anabaena sp. PCC7120, is het een uitdaging om de filamenten in een verticale positie te houden vanwege de grootte van de cellen en de lengte van de filamenten. In dit artikel beschrijven we een methode die de verticale immobilisatie van Anabaena sp. PCC 7120-filamenten mogelijk maakt met behulp van agarose met een laag smeltpunt en spuiten, om de Z-ring vast te leggen in een mutant die een FtsZ-sfGFP-fusie-eiwit tot expressie brengt. Deze methode is een snelle en goedkope manier om eiwitdynamica op de delingsplaats te registreren met behulp van confocale microscopie.
Introduction
Bacteriële celdeling is het proces waarbij een moedercel twee dochtercellen genereert, in de meeste gevallen door het mechanisme dat bekend staat als binaire splijting. Een van de vroegste gebeurtenissen in het septatieproces is de lokalisatie van FtsZ in het midden van de cel1. Dit eiwit, dat structureel homoloog is aan tubuline2, is geconserveerd en wijd verspreid in de meeste bacteriën, en de polymerisatie ervan genereert een contractiele structuur die bekend staat als de Z-ring3. Deze ring dient als een steiger voor andere delingseiwitten en samen vormen ze een moleculaire machinerie die een divisoom wordt genoemd. Verschillende studies hebben aangetoond dat de Z-ring zeer dynamisch is en dat FtsZ-protofilamenten bewegen door loopband 4,5,6. Om de Z-ring in time-lapse-experimenten te bestuderen, is het raadzaam om de delingsplaats in het XY-vlak vast te leggen voor een betere resolutie en snelle bemonstering. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om verticale celimmobilisatiemethoden te ontwikkelen die gewoonlijk de nanofabricage van microgatcelvallen en complexe microfluïdische apparaten omvatten7.
Cyanobacteriën zijn fotosynthetische micro-organismen die door hun cellulaire morfologie als gramnegatief worden geclassificeerd. Fylogenetisch staan ze echter dichter bij grampositieve bacteriën8. Deze organismen hebben celdelingsgenen die veel voorkomen in grampositieve en gramnegatieve bacteriën, maar hun divisoom bevat ook unieke elementen9. Anabaena sp. PCC 7120 (hierna Anabaena sp.) is filamenteuze cyanobacteriën met één delingsvlak en is een model voor de studie van celdeling in meercellige cyanobacteriën. In deze stam is het mogelijk geweest om de positionering van FtsZ in het midden van de cellente bepalen 10. Toch zijn er geen studies die de in vivo dynamiek van FtsZ in dit model aantonen. In ons laboratorium verkregen we door triparentale paring en homologe recombinatie een volledig gescheiden mutant van Anabaena sp. die het FtsZ-eiwit tot expressie brengt dat is gefuseerd met sfGFP, dat het volledige endogene ftsZ-gen verving. We ontwikkelden een snelle en eenvoudige celimmobilisatiemethode die de verticale oriëntatie van de mutante stamfilamenten bevordert voor time-lapse-experimenten om de delingseiwitten in filamenteuze cyanobacteriën te visualiseren. Deze methode heeft geen microfluïdische apparaten nodig die duur en moeilijk te ontwikkelen kunnen zijn. Als voorbeeld gebruikten we dit protocol om de Z-ring in de FtsZ-sfGFP-mutant te visualiseren door confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie van de dynamiek van divisoomeiwitten is zonder twijfel een uitdaging. Met name bij filamenteuze cyanobacteriën is een van de uitdagingen de visualisatie van de Z-ring in het horizontale vlak, waarvoor de cellen verticaal georiënteerd moeten zijn. De methode die we hier hebben beschreven, maakt het mogelijk om de positie van de Z-ring in het XY-vlak uit te voeren van de verschillende analyses. Dit is de eerste eenvoudige methode voor filamenteuze cyanobacteriën die de volledige visualisatie van de Z-ring moge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de nationale doctoraatsbeurzen (ANID 21211333; 21191389) dankbaar voor de financiering. Grant Fondecyt 1161232.
Dit werk werd ondersteund door de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
