糸状シアノバクテリアのタイムラプス顕微鏡分析のための垂直固定化法
Summary
我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。
Abstract
細菌細胞分裂の主なイベントは、タンパク質FtsZが重要な要素である分離プロセスです。FtsZは重合し、細胞の中央にリング状の構造(Zリング)を形成し、他の分裂タンパク質の足場として機能します。細菌モデル である大腸 菌と 枯草菌 の超解像顕微鏡では、Zリングが不連続であることが示され、ライブセルイメージング研究では、FtsZがトレッドミルと呼ばれるメカニズムによってリングに沿って移動することが示されました。 in vivoでのFtsZのダイナミクスを研究するには、XY平面内のリングの完全な構造をイメージングするために、垂直位置での特別な細胞配置が必要です。 Anabaena sp. PCC7120などの多細胞シアノバクテリアにおけるFtsZイメージングの場合、細胞のサイズとフィラメントの長さのために、フィラメントを垂直位置に維持することは困難です。本稿では、低融点アガロースとシリンジを用いて Anabaena sp. PCC 7120フィラメントを垂直固定化し、FtsZ-sfGFP融合タンパク質を発現する変異体でZリングを記録する方法について説明します。この方法は、共焦点顕微鏡を使用して分裂部位のタンパク質動態を登録するための迅速かつ安価な方法です。
Introduction
細菌の細胞分裂は、母細胞が2つの娘細胞を生成するプロセスであり、ほとんどの場合、二元分裂として知られるメカニズムによるものです。分離プロセスにおける最も初期のイベントの1つは、細胞1の中央でのFtsZの局在化です。チューブリン2と構造的に相同なこのタンパク質は、ほとんどの細菌に保存され、広く分布しており、その重合はZリング3として知られる収縮構造を生成します。このリングは、他の分裂タンパク質の足場として機能し、一緒になってディビソームと呼ばれる分子機構を形成します。いくつかの研究は、Zリングが非常に動的であり、FtsZプロトフィラメントがトレッドミルによって動くことを示しています4,5,6。タイムラプス実験でZリングを研究するには、より良い分解能と迅速なサンプリングのために、分割サイトをXY平面に記録することをお勧めします。これを達成するためには、マイクロホールセルトラップや複雑なマイクロ流体デバイス7のナノファブリケーションを一般的に含む垂直細胞固定化法を開発する必要がある。
シアノバクテリアは、その細胞形態によってグラム陰性に分類される光合成微生物です。しかし、系統発生的にはグラム陽性菌に近い8。これらの生物は、グラム陽性菌とグラム陰性菌に共通する細胞分裂遺伝子を持っていますが、それらの分割体には固有の要素も含まれています9。Anabaena sp. PCC 7120(以下、Anabaena sp.)は、1つの分裂面を持つ糸状藍藻であり、多細胞藍藻の細胞分裂研究のモデルである。この菌株では、細胞10の途中におけるFtsZの位置を決定することができた。それにもかかわらず、このモデルにおけるFtsZのin vivoダイナミクスを示す研究はありません。私たちの研究室では、三親交配と相同組換えにより、完全な内因性ftsZ遺伝子に置き換わるsfGFPに融合したFtsZタンパク質を発現するアナバエナ属の完全分離変異体を取得しました。我々は、糸状藍藻の分裂タンパク質を可視化するためのタイムラプス実験のために、変異株フィラメントの垂直配向を支持する迅速かつ簡便な細胞固定化法を開発しました。この方法は、高価で開発が困難なマイクロ流体デバイスを必要としません。一例として、このプロトコルを使用して、共焦点顕微鏡によってFtsZ-sfGFP変異体のZリングを視覚化しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ディビソームタンパク質の動態の研究は間違いなく挑戦です。特に糸状藍藻では、細胞を垂直に配向させる水平面内のZリングを可視化することが課題の一つである。ここで説明した方法では、XY平面内のZリングを配置してさまざまな分析を実行できます。これは、Zリングの完全な可視化を可能にする糸状シアノバクテリアの最初の簡単な方法です。
このプロトコルは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金提供のための国家博士奨学金(ANID 21211333; 21191389)に感謝します。グラントフォンデサイト1161232。
この研究は、de Advanced Microscopy Facility UMA UCの支援を受けました。
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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