Метод вертикальной иммобилизации для анализа методом покадровой микроскопии нитчатых цианобактерий
Summary
Представлен простой и доступный метод нитевидной визуализации цианобактерий в плоскости XY. Была использована агарозная матрица с низкой температурой плавления, позволяющая получать изображения белков, участвующих в делении, в вертикальной ориентации. Таким образом, эта методика может быть применена к любому нитевидному организму и различным видам белков.
Abstract
Основным событием в делении бактериальных клеток является процесс септации, где белок FtsZ является ключевым элементом. FtsZ полимеризуется, образуя кольцеобразную структуру (Z-кольцо) в середине клетки, которая служит каркасом для других белков деления. Микроскопия сверхвысокого разрешения на бактериальных моделях Escherichia coli и Bacillus subtilis показала, что Z-кольцо является прерывистым, в то время как исследования визуализации живых клеток показали, что FtsZ движется вдоль кольца с помощью механизма, известного как беговая дорожка. Для изучения динамики FtsZ in vivo необходимо специальное размещение ячейки в вертикальном положении для визуализации полной структуры кольца в плоскости XY. В случае визуализации FtsZ у многоклеточных цианобактерий, таких как Anabaena sp. PCC7120, поддержание нитей в вертикальном положении является сложной задачей из-за размера клеток и длины нитей. В этой статье мы описываем метод, который позволяет вертикально иммобилизовать нити Anabaena sp. PCC 7120 с использованием агарозы и шприцев с низкой температурой плавления для записи Z-кольца в мутанте, экспрессирующем слитый белок FtsZ-sfGFP. Этот метод является быстрым и недорогим способом регистрации динамики белка в месте деления с помощью конфокальной микроскопии.
Introduction
Деление бактериальных клеток — это процесс, при котором материнская клетка генерирует две дочерние клетки, в большинстве случаев с помощью механизма, известного как бинарное деление. Одним из самых ранних событий в процессе септации является локализация FtsZ в середине клетки1. Этот белок, который структурно гомологичен тубулину2, сохраняется и широко распространен у большинства бактерий, а его полимеризация создает сократительную структуру, известную как Z-кольцо3. Это кольцо служит каркасом для других белков деления, и вместе они образуют молекулярный механизм, называемый дивисомой. Несколько исследований показали, что Z-кольцо очень динамично и что протофиламенты FtsZ движутся с помощью беговой дорожки 4,5,6. Для изучения Z-кольца в покадровых экспериментах целесообразно записать участок деления в плоскости XY для лучшего разрешения и быстрой выборки. Для достижения этой цели необходимо разработать методы вертикальной иммобилизации клеток, которые обычно включают наноизготовление микродырочных клеточных ловушек и сложных микрофлюидных устройств7.
Цианобактерии – это фотосинтезирующие микроорганизмы, которые классифицируются как грамотрицательные по своей клеточной морфологии. Однако филогенетически они ближе к грамположительным бактериям8. Эти организмы имеют гены клеточного деления, которые распространены в грамположительных и грамотрицательных бактериях, но их дивисома также содержит уникальные элементы9. Anabaena sp. PCC 7120 (далее Anabaena sp.) представляет собой нитчатые цианобактерии с одной плоскостью деления и является моделью для изучения клеточного деления у многоклеточных цианобактерий. В этом штамме удалось определить положение FtsZ в середине ячеек10. Тем не менее, исследований, показывающих динамику FtsZ in vivo в этой модели, нет. В нашей лаборатории путем триродительского спаривания и гомологичной рекомбинации мы получили полностью сегрегированный мутант Anabaena sp., который экспрессирует белок FtsZ, слитый с sfGFP, который заменил полный эндогенный ген ftsZ. Мы разработали быстрый и простой метод иммобилизации клеток, который способствует вертикальной ориентации нитей мутантных штаммов для покадровых экспериментов по визуализации белков деления в нитевидных цианобактериях. Этот метод не нуждается в микрофлюидных устройствах, которые могут быть дорогими и сложными в разработке. В качестве примера мы использовали этот протокол для визуализации Z-кольца в мутанте FtsZ-sfGFP с помощью конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение динамики дивисомных белков, без сомнения, является сложной задачей. В частности, у нитчатых цианобактерий одной из проблем является визуализация Z-кольца в горизонтальной плоскости, для чего клетки должны быть ориентированы вертикально. Метод, который мы здесь описали, позвол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Национальным докторским стипендиям (ANID 21211333; 21191389) за финансирование. Грант Фондецит 1161232.
Эта работа была поддержана de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
