Presentiamo un metodo semplice e accessibile per la visualizzazione cianobatterica filamentosa nel piano XY. È stata utilizzata una matrice di agarosio a basso punto di fusione, che consente l’acquisizione di immagini di proteine coinvolte nella divisione, con orientamento verticale. Pertanto, questa metodologia può essere applicata a qualsiasi organismo filamentoso e diversi tipi di proteine.
Un evento principale nella divisione cellulare batterica è il processo di settizione, dove la proteina FtsZ è l’elemento chiave. FtsZ polimerizza formando una struttura ad anello (Z-ring) nel mezzo della cellula che funge da impalcatura per altre proteine di divisione. La microscopia a super-risoluzione in modelli batterici Escherichia coli e Bacillus subtilis ha mostrato che l’anello Z è discontinuo, mentre studi di imaging cellulare vivo hanno dimostrato che FtsZ si muove lungo l’anello con un meccanismo noto come tapis roulant. Per studiare la dinamica di FtsZ in vivo, è necessario uno speciale posizionamento delle celle in posizione verticale per l’imaging della struttura completa dell’anello nel piano XY. Nel caso dell’imaging FtsZ nei cianobatteri multicellulari, come Anabaena sp. PCC7120, mantenere i filamenti in posizione verticale è difficile a causa delle dimensioni delle cellule e della lunghezza dei filamenti. In questo articolo, descriviamo un metodo che consente l’immobilizzazione verticale dei filamenti di Anabaena sp. PCC 7120 utilizzando agarosio a basso punto di fusione e siringhe, per registrare l’anello Z in un mutante che esprime una proteina di fusione FtsZ-sfGFP. Questo metodo è un modo rapido ed economico per registrare la dinamica delle proteine nel sito di divisione utilizzando la microscopia confocale.
La divisione cellulare batterica è il processo in cui una cellula madre genera due cellule figlie, nella maggior parte dei casi dal meccanismo noto come fissione binaria. Uno dei primi eventi nel processo di settazione è la localizzazione di FtsZ nel mezzo della cella1. Questa proteina, che è strutturalmente omologa alla tubulina2, è conservata e ampiamente distribuita nella maggior parte dei batteri e la sua polimerizzazione genera una struttura contrattile nota come Z-ring3. Questo anello funge da impalcatura per altre proteine di divisione e insieme formano un meccanismo molecolare chiamato divisomia. Diversi studi hanno dimostrato che l’anello Z è altamente dinamico e che i protofilamenti FtsZ si muovono per tapis roulant 4,5,6. Per studiare l’anello Z in esperimenti time-lapse, è consigliabile registrare il sito di divisione nel piano XY per una migliore risoluzione e un campionamento rapido. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario sviluppare metodi di immobilizzazione cellulare verticale che includano comunemente la nanofabbricazione di trappole cellulari microforate e dispositivi microfluidici complessi7.
I cianobatteri sono microrganismi fotosintetici classificati come gram-negativi dalla loro morfologia cellulare. Tuttavia, filogeneticamente sono più vicini ai batteri gram-positivi8. Questi organismi hanno geni di divisione cellulare che sono comuni all’interno dei batteri gram-positivi e gram-negativi, ma il loro divisore contiene anche elementi unici9. PCC 7120 (di seguito Anabaena sp.) è un cianobatterio filamentoso con un piano di divisione ed è un modello per lo studio della divisione cellulare nei cianobatteri multicellulari. In questo ceppo, è stato possibile determinare il posizionamento di FtsZ al centro delle celle10. Tuttavia, non ci sono studi che mostrano la dinamica in vivo di FtsZ in questo modello. Nel nostro laboratorio, attraverso l’accoppiamento triparentale e la ricombinazione omologa, abbiamo ottenuto un mutante totalmente segregato di Anabaena sp. che esprime la proteina FtsZ fusa a sfGFP, che ha sostituito il gene ftsZ endogeno completo. Abbiamo sviluppato un metodo di immobilizzazione cellulare rapido e semplice che favorisce l’orientamento verticale dei filamenti di ceppo mutanti per esperimenti time-lapse per visualizzare le proteine di divisione nei cianobatteri filamentosi. Questo metodo non ha bisogno di dispositivi microfluidici che possono essere costosi e difficili da sviluppare. Ad esempio, abbiamo usato questo protocollo per visualizzare l’anello Z nel mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopia confocale.
Lo studio della dinamica delle proteine divisive è senza dubbio una sfida. In particolare, nei cianobatteri filamentosi, una delle sfide è la visualizzazione dell’anello Z nel piano orizzontale, per il quale le cellule devono essere orientate verticalmente. Il metodo che abbiamo descritto qui consente il posizionamento dell’anello Z nel piano XY per eseguire le diverse analisi. Questo è il primo metodo semplice per cianobatteri filamentosi che consente la visualizzazione completa dell’anello Z.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Siamo grati alle borse di dottorato nazionali (ANID 21211333; 21191389) per il finanziamento. Grant Fondecyt 1161232.
Questo lavoro è stato sostenuto da de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
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