שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה
Summary
אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.
Abstract
אירוע מרכזי בחלוקת תאי חיידקים הוא תהליך הספטציה, שבו החלבון FtsZ הוא מרכיב המפתח. FtsZ מתפלמר ויוצר מבנה דמוי טבעת (טבעת Z) במרכז התא המשמש כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים. מיקרוסקופ ברזולוציית על במודלים חיידקיים Escherichia coli ו – Bacillus subtilis הראה כי טבעת Z אינה רציפה, בעוד מחקרי הדמיה של תאים חיים הראו כי FtsZ נע לאורך הטבעת על ידי מנגנון המכונה הליכון. כדי ללמוד את הדינמיקה של FtsZ in vivo, מיקום תא מיוחד במצב אנכי נחוץ להדמיית המבנה המלא של הטבעת במישור XY. במקרה של דימות FtsZ בציאנובקטריה רב-תאית, כגון Anabaena sp. PCC7120, שמירה על החוטים במצב אנכי היא מאתגרת בגלל גודל התאים ואורך החוטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת אימוביליזציה אנכית של חוטי Anabaena sp. PCC 7120 באמצעות נקודת התכה נמוכה agarose ומזרקים, כדי להקליט את טבעת Z במוטציה המבטאת חלבון היתוך FtsZ-sfGFP. שיטה זו היא דרך מהירה וזולה לרשום דינמיקה של חלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
Introduction
חלוקת תאי חיידקים היא תהליך שבו תא אם מייצר שני תאי בת, ברוב המקרים על ידי מנגנון המכונה ביקוע בינארי. אחד האירועים המוקדמים ביותר בתהליך המחיצה הוא לוקליזציה של FtsZ באמצע התא1. חלבון זה, שהוא הומולוגי מבחינה מבנית לטובולין2, נשמר ומופץ באופן נרחב ברוב החיידקים, והפילמור שלו יוצר מבנה כיווץ המכונה טבעת Z3. טבעת זו משמשת כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים ויחד הם יוצרים מנגנון מולקולרי הנקרא דיוויזום. מספר מחקרים הראו כי טבעת Z היא דינמית מאוד וכי פרוטופילמנטים FtsZ נעים על ידי הליכון 4,5,6. כדי לחקור את טבעת Z בניסויי קיטועי זמן, מומלץ להקליט את אתר החלוקה במישור XY לרזולוציה טובה יותר ולדגימה מהירה. על מנת להשיג זאת, יש צורך לפתח שיטות אימוביליזציה של תאים אנכיים הכוללות בדרך כלל ננו-ייצור של מלכודות תאי מיקרו-חורים והתקנים מיקרופלואידים מורכבים7.
ציאנובקטריה הם מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המסווגים כגראם-שליליים על ידי המורפולוגיה התאית שלהם. עם זאת, מבחינה פילוגנטית הם קרובים יותר לחיידקים גראם-חיוביים8. לאורגניזמים אלה יש גנים של חלוקת תאים הנפוצים בחיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, אך הדיוויזום שלהם מכיל גם יסודות ייחודיים9. Anabaena sp. PCC 7120 (להלן Anabaena sp.) הוא ציאנובקטריה נימית בעלת מישור חלוקה אחד והיא מודל לחקר חלוקת תאים בציאנובקטריה רב-תאית. בזן זה, ניתן היה לקבוע את המיקום של FtsZ באמצע התאים10. עם זאת, אין מחקרים המראים את הדינמיקה in vivo של FtsZ במודל זה. במעבדה שלנו, באמצעות הזדווגות תלת-הורית ורקומבינציה הומולוגית, השגנו מוטציה מופרדת לחלוטין של Anabaena sp. המבטאת את חלבון FtsZ המאוחה ל-sfGFP, שהחליף את הגן ftsZ האנדוגני המלא. פיתחנו שיטת אימוביליזציה מהירה ופשוטה של תאים המעדיפה את הכיוון האנכי של חוטי הזן המוטנטי לניסויים בהילוך מהיר כדי לדמיין את חלבוני החלוקה בציאנובקטריה נימה. שיטה זו אינה זקוקה להתקנים מיקרופלואידים שיכולים להיות יקרים וקשים לפיתוח. לדוגמה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לדמיין את טבעת Z במוטציה FtsZ-sfGFP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
חקר הדינמיקה של חלבונים דיוויזומים הוא ללא ספק אתגר. בפרט, בציאנובקטריה נימה, אחד האתגרים הוא הדמיה של טבעת Z במישור האופקי, שעבורה התאים חייבים להיות בכיוון אנכי. השיטה שתיארנו כאן מאפשרת את מיקום טבעת Z במישור XY לביצוע הניתוחים השונים. זוהי השיטה הפשוטה הראשונה עבור ציאנובקטריה נימה המאפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה למלגות הדוקטורט הלאומיות (ANID 21211333; 21191389) על המימון. גרנט פונדסיט 1161232.
עבודה זו נתמכה על ידי de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
