필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법
Summary
우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.
Abstract
박테리아 세포 분열의 주요 사건은 단백질 FtsZ가 핵심 요소인 중격 과정입니다. FtsZ는 중합되어 세포의 중간에 고리형 구조(Z-ring)를 형성하여 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 한다. 박테리아 모델 대장균(Escherichia coli) 과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis )의 초고해상도 현미경은 Z-링이 불연속적이라는 것을 보여주었고, 라이브 셀 이미징 연구는 FtsZ가 트레드밀링으로 알려진 메커니즘에 의해 링을 따라 움직이는 것으로 나타났습니다. 생체 내에서 FtsZ의 역학을 연구하기 위해서는 XY 평면에서 링의 전체 구조를 이미징하기 위해 수직 위치에 특수 셀 배치가 필요합니다. Anabaena sp. PCC7120와 같은 다세포 시아노박테리아에서 FtsZ 이미징의 경우 세포의 크기와 필라멘트의 길이 때문에 필라멘트를 수직 위치로 유지하는 것이 어렵습니다. 이 기사에서는 Anabaena sp. PCC 7120 필라멘트는 저융점 아가로스와 주사기를 사용하여 FtsZ-sfGFP 융합 단백질을 발현하는 돌연변이에서 Z-링을 기록합니다. 이 방법은 컨포칼 현미경을 사용하여 분열 부위에서 단백질 역학을 빠르고 저렴하게 기록할 수 있는 방법입니다.
Introduction
박테리아 세포 분열은 모세포가 두 개의 딸 세포를 생성하는 과정으로, 대부분의 경우 이분법으로 알려진 메커니즘에 의해 생성됩니다. 중격 과정에서 가장 초기의 사건 중 하나는 셀1의 중간에 FtsZ의 국소화입니다. 튜불린2와 구조적으로 상동성인 이 단백질은 보존되어 대부분의 박테리아에 널리 분포되어 있으며, 중합은 Z-링3으로 알려진 수축 구조를 생성합니다. 이 고리는 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 하며 함께 점쟁이라고 하는 분자 기계를 형성합니다. 여러 연구에 따르면 Z-링은 매우 역동적이며 FtsZ 프로토필라멘트는 트레드밀링 4,5,6에 의해 움직입니다. 타임랩스 실험에서 Z-링을 연구하려면 더 나은 해상도와 빠른 샘플링을 위해 XY 평면에 분할 부위를 기록하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기 위해서는 일반적으로 마이크로홀 세포 트랩 및 복잡한 미세유체 장치의 나노 제조를 포함하는 수직 세포 고정화 방법을 개발할 필요가 있습니다(7).
시아노박테리아는 세포 형태에 따라 그람 음성으로 분류되는 광합성 미생물입니다. 그러나 계통발생학적으로 그들은 그람 양성균에 더 가깝다8. 이 유기체는 그람 양성균과 그람 음성균 내에서 흔히 볼 수 있는 세포 분열 유전자를 가지고 있지만, 그 점에는 독특한 원소도 포함되어 있다9. Anabaena sp. PCC 7120(이하 Anabaena sp.)은 하나의 분열면을 가진 필라멘트 시아노박테리아로 다세포 시아노박테리아의 세포 분열 연구를 위한 모델입니다. 이러한 변형에서, 셀(10)의 중간에서 FtsZ의 위치를 결정하는 것이 가능하였다. 그럼에도 불구하고 이 모델에서 FtsZ의 생체 내 역학을 보여주는 연구는 없습니다. 우리 실험실에서는 삼부모 짝짓기와 상동 재조합을 통해 완전히 분리된 Anabaena sp. 완전한 내인성 ftsZ 유전자를 대체한 sfGFP에 융합된 FtsZ 단백질을 발현합니다. 우리는 필라멘트 시아노박테리아의 분열 단백질을 시각화하기 위한 타임랩스 실험을 위해 돌연변이 균주 필라멘트의 수직 방향을 선호하는 빠르고 간단한 세포 고정화 방법을 개발했습니다. 이 방법은 비싸고 개발하기 어려울 수 있는 미세유체 장치가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 공초점 현미경으로 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
나뭇잎 단백질의 역학에 대한 연구는 의심할 여지 없이 도전 과제입니다. 특히, 필라멘트 시아노박테리아에서 과제 중 하나는 세포가 수직 방향이어야 하는 수평면에서 Z-링을 시각화하는 것입니다. 여기에서 설명한 방법을 사용하면 XY 평면에서 Z-링을 배치하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 Z-링의 완전한 시각화를 가능하게 하는 사상 시아노박테리아에 대한 최초의 간단한 방법입?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
자금 조달을 위해 국립 박사 장학금 (ANID 21211333; 21191389)에 감사드립니다. 그랜트 폰데시트 1161232.
이 작업은 고급 현미경 시설 UMA UC의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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