Procédé d’immobilisation verticale pour analyse de microscopie accélérée dans des cyanobactéries filamenteuses
Summary
Nous présentons une méthode simple et accessible pour la visualisation filamenteuse des cyanobactéries dans le plan XY. Une matrice d’agarose à bas point de fusion a été utilisée, permettant l’acquisition d’images des protéines impliquées dans la division, dans une orientation verticale. Par conséquent, cette méthodologie peut être appliquée à n’importe quel organisme filamenteux et à différents types de protéines.
Abstract
Un événement principal dans la division cellulaire bactérienne est le processus de septation, où la protéine FtsZ est l’élément clé. FtsZ polymérise en formant une structure en forme d’anneau (anneau Z) au milieu de la cellule qui sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division. La microscopie à super-résolution dans les modèles bactériens Escherichia coli et Bacillus subtilis a montré que l’anneau Z est discontinu, tandis que les études d’imagerie sur cellules vivantes ont démontré que FtsZ se déplace le long de l’anneau par un mécanisme connu sous le nom de tapis roulant. Pour étudier la dynamique de FtsZ in vivo, un placement spécial de la cellule en position verticale est nécessaire pour imager la structure complète de l’anneau dans le plan XY. Dans le cas de l’imagerie FtsZ chez les cyanobactéries multicellulaires, telles que Anabaena sp. PCC7120, le maintien des filaments en position verticale est difficile en raison de la taille des cellules et de la longueur des filaments. Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet l’immobilisation verticale des filaments Anabaena sp. PCC 7120 à l’aide d’agarose à bas point de fusion et de seringues, pour enregistrer l’anneau Z dans un mutant qui exprime une protéine de fusion FtsZ-sfGFP. Cette méthode est un moyen rapide et peu coûteux d’enregistrer la dynamique des protéines au site de division en utilisant la microscopie confocale.
Introduction
La division cellulaire bactérienne est le processus par lequel une cellule mère génère deux cellules filles, dans la plupart des cas par le mécanisme connu sous le nom de fission binaire. L’un des premiers événements dans le processus de septation est la localisation de FtsZ au milieu de la cellule1. Cette protéine, structurellement homologue à la tubuline2, est conservée et largement distribuée dans la plupart des bactéries, et sa polymérisation génère une structure contractile connue sous le nom d’anneau Z3. Cet anneau sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division et ensemble, elles forment une machinerie moléculaire appelée divisome. Plusieurs études ont montré que l’anneau Z est très dynamique et que les protofilaments FtsZ se déplacent en roulant 4,5,6. Pour étudier l’anneau Z dans des expériences time-lapse, il est conseillé d’enregistrer le site de division dans le plan XY pour une meilleure résolution et un échantillonnage rapide. Pour ce faire, il est nécessaire de développer des méthodes d’immobilisation cellulaire verticale qui incluent généralement la nanofabrication de pièges cellulaires à microtrous et de dispositifs microfluidiques complexes7.
Les cyanobactéries sont des micro-organismes photosynthétiques classés à Gram négatif par leur morphologie cellulaire. Cependant, phylogénétiquement ils sont plus proches des bactéries gram-positives8. Ces organismes ont des gènes de division cellulaire qui sont communs chez les bactéries gram-positives et gram-négatives, mais leur divisome contient également des éléments uniques9. Anabaena sp. PCC 7120 (ci-après Anabaena sp.) est une cyanobactérie filamenteuse à un plan de division et est un modèle pour l’étude de la division cellulaire chez les cyanobactéries multicellulaires. Dans cette souche, il a été possible de déterminer le positionnement de FtsZ au milieu des cellules10. Néanmoins, il n’y a pas d’études montrant la dynamique in vivo de FtsZ dans ce modèle. Dans notre laboratoire, grâce à l’accouplement triparental et à la recombinaison homologue, nous avons obtenu un mutant totalement séparé d’Anabaena sp. qui exprime la protéine FtsZ fusionnée au sfGFP, qui a remplacé le gène ftsZ endogène complet. Nous avons développé une méthode d’immobilisation cellulaire rapide et simple qui favorise l’orientation verticale des filaments de souche mutants pour des expériences en accéléré afin de visualiser les protéines de division dans les cyanobactéries filamenteuses. Cette méthode ne nécessite pas de dispositifs microfluidiques qui peuvent être coûteux et difficiles à développer. À titre d’exemple, nous avons utilisé ce protocole pour visualiser l’anneau Z dans le mutant FtsZ-sfGFP par microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude de la dynamique des protéines divisomiques est sans aucun doute un défi. En particulier, chez les cyanobactéries filamenteuses, l’un des défis est la visualisation de l’anneau Z dans le plan horizontal, pour lequel les cellules doivent être orientées verticalement. La méthode que nous avons décrite ici permet le positionnement de l’anneau Z dans le plan XY pour effectuer les différentes analyses. C’est la première méthode simple pour les cyanobactéries filamenteuses qui permet la visualisat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants aux bourses doctorales nationales (ANID 21211333; 21191389) pour le financement. Grant Fondecyt 1161232.
Ce travail a été soutenu par de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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