Filamentli Siyanobakterilerde Hızlandırılmış Mikroskopi Analizi için Dikey İmmobilizasyon Yöntemi
Summary
XY düzleminde filamentli siyanobakteriyel görselleştirme için basit ve erişilebilir bir yöntem sunuyoruz. Düşük erime noktalı bir agaroz matrisi kullanıldı ve bölünmede yer alan proteinlerin görüntülerinin dikey bir yönde elde edilmesine izin verildi. Bu nedenle, bu metodoloji herhangi bir filamentli organizmaya ve farklı protein türlerine uygulanabilir.
Abstract
Bakteriyel hücre bölünmesindeki ana olay, FtsZ proteininin anahtar element olduğu septasyon işlemidir. FtsZ, hücrenin ortasında, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi gören halka benzeri bir yapı (Z-halkası) oluşturan polimerize olur. Bakteriyel modellerde süper çözünürlüklü mikroskopi Escherichia coli ve Bacillus subtilis , Z-halkasının süreksiz olduğunu gösterirken, canlı hücre görüntüleme çalışmaları FtsZ’nin halka boyunca koşu bandı olarak bilinen bir mekanizma ile hareket ettiğini gösterdi. FtsZ’nin dinamiklerini in vivo olarak incelemek için, XY düzlemindeki halkanın tüm yapısını görüntülemek için dikey konumda özel bir hücre yerleşimi gereklidir. Anabaena sp. PCC7120 gibi çok hücreli siyanobakterilerde FtsZ görüntüleme durumunda, filamentlerin dikey konumda tutulması, hücrelerin büyüklüğü ve filamentlerin uzunluğu nedeniyle zordur. Bu makalede, Z-halkasını bir FtsZ-sfGFP füzyon proteinini ifade eden bir mutantta kaydetmek için Anabaena sp. PCC 7120 filamentlerinin düşük erime noktalı agaroz ve şırıngalar kullanılarak dikey immobilizasyonuna izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanarak bölünme bölgesinde protein dinamiklerini kaydetmenin hızlı ve ucuz bir yoludur.
Introduction
Bakteriyel hücre bölünmesi, bir ana hücrenin, çoğu durumda ikili fisyon olarak bilinen mekanizma ile iki yavru hücre ürettiği süreçtir. Septasyon sürecindeki en erken olaylardan biri, FtsZ’ninhücre 1’in ortasında lokalizasyonudur. Yapısal olarak tübülin2’ye homolog olan bu protein, çoğu bakteride korunur ve yaygın olarak dağıtılır ve polimerizasyonu Z-halka3 olarak bilinen bir kasılma yapısı oluşturur. Bu halka, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi görür ve birlikte bölücü adı verilen moleküler bir makine oluştururlar. Birçok çalışma, Z-halkasının oldukça dinamik olduğunu ve FtsZ protofilamentlerinin 4,5,6 koşu bandı ile hareket ettiğini göstermiştir. Hızlandırılmış deneylerde Z-halkasını incelemek için, daha iyi çözünürlük ve hızlı örnekleme için bölme bölgesini XY düzleminde kaydetmeniz önerilir. Bunu başarmak için, genellikle mikrodelik hücre tuzaklarının ve karmaşık mikroakışkan cihazların nanofabrikasyonunu içeren dikey hücre immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir7.
Siyanobakteriler, hücresel morfolojilerine göre gram-negatif olarak sınıflandırılan fotosentetik mikroorganizmalardır. Bununla birlikte, filogenetik olarak gram-pozitif bakterilere daha yakındırlar8. Bu organizmalar, gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerde yaygın olan hücre bölünme genlerine sahiptir, ancak bölücüleri de benzersiz elementler içerir9. Anabaena sp. PCC 7120 (bundan böyle Anabaena sp.) bir bölünme düzlemine sahip filamentli siyanobakterilerdir ve çok hücreli siyanobakterilerde hücre bölünmesinin incelenmesi için bir modeldir. Bu suşta, FtsZ’nin hücrelerin ortasındaki konumunu belirlemek mümkün olmuştur10. Bununla birlikte, bu modelde FtsZ’nin in vivo dinamiklerini gösteren hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Laboratuvarımızda, triparental çiftleşme ve homolog rekombinasyon yoluyla, tam endojen ftsZ geninin yerini alan sfGFP’ye kaynaşmış FtsZ proteinini ifade eden tamamen ayrılmış bir Anabaena sp. mutantı elde ettik. Filamentli siyanobakterilerdeki bölünme proteinlerini görselleştirmek için hızlandırılmış deneyler için mutant suş filamentlerinin dikey oryantasyonunu destekleyen hızlı ve basit bir hücre immobilizasyon yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, pahalı ve geliştirilmesi zor olabilecek mikroakışkan cihazlara ihtiyaç duymaz. Örnek olarak, bu protokolü FtsZ-sfGFP mutantındaki Z-halkasını konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bölücü proteinlerin dinamiklerinin incelenmesi şüphesiz bir meydan okumadır. Özellikle, filamentli siyanobakterilerde, zorluklardan biri, hücrelerin dikey olarak yönlendirilmesi gereken yatay düzlemde Z-halkasının görselleştirilmesidir. Burada tarif ettiğimiz yöntem, farklı analizleri gerçekleştirmek için Z-halkasının XY düzleminde konumlandırılmasını sağlar. Bu, Z-halkasının tam olarak görselleştirilmesini sağlayan filamentli siyanobakteriler için ilk basit yöntemdir.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman için Ulusal doktora burslarına (ANID 21211333; 21191389) minnettarız. Grant Fondecyt 1161232.
Bu çalışma de Advanced Microscopy Facility UMA UC tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
