Vertikale Immobilisierungsmethode für die zeitraffermikroskopische Analyse in filamentösen Cyanobakterien
Summary
Wir stellen eine einfache und zugängliche Methode zur Visualisierung filamentöser Cyanobakterien in der XY-Ebene vor. Es wurde eine Agarosematrix mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet, die die Aufnahme von Bildern von Proteinen, die an der Teilung beteiligt sind, in vertikaler Ausrichtung ermöglicht. Daher kann diese Methodik auf jeden fadenförmigen Organismus und verschiedene Arten von Proteinen angewendet werden.
Abstract
Ein Hauptereignis bei der bakteriellen Zellteilung ist der Septierungsprozess, bei dem das Protein FtsZ das Schlüsselelement ist. FtsZ polymerisiert und bildet in der Mitte der Zelle eine ringförmige Struktur (Z-Ring), die als Gerüst für andere Teilungsproteine dient. Hochauflösende Mikroskopie in den Bakterienmodellen Escherichia coli und Bacillus subtilis zeigte, dass der Z-Ring diskontinuierlich ist, während Lebendzell-Bildgebungsstudien zeigten, dass sich FtsZ durch einen Mechanismus, der als Lauffräsen bekannt ist, entlang des Rings bewegt. Um die Dynamik von FtsZ in vivo zu untersuchen, ist eine spezielle Zellplatzierung in vertikaler Position notwendig, um die komplette Struktur des Rings in der XY-Ebene abzubilden. Im Falle der FtsZ-Bildgebung in mehrzelligen Cyanobakterien wie Anabaena sp. PCC7120 ist es aufgrund der Größe der Zellen und der Länge der Filamente schwierig, die Filamente in einer vertikalen Position zu halten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die vertikale Immobilisierung von Anabaena sp. PCC 7120 Filamenten unter Verwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Spritzen ermöglicht, um den Z-Ring in einer Mutante zu erfassen, die ein FtsZ-sfGFP-Fusionsprotein exprimiert. Diese Methode ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Proteindynamik an der Teilungsstelle mittels konfokaler Mikroskopie zu registrieren.
Introduction
Die bakterielle Zellteilung ist der Prozess, bei dem eine Mutterzelle zwei Tochterzellen erzeugt, in den meisten Fällen durch den Mechanismus, der als binäre Spaltung bekannt ist. Eines der frühesten Ereignisse im Septationsprozess ist die Lokalisierung von FtsZ in der Mitte der Zelle1. Dieses Protein, das strukturell homolog zu Tubulin2 ist, ist in den meisten Bakterien konserviert und weit verbreitet, und seine Polymerisation erzeugt eine kontraktile Struktur, die als Z-Ring3 bekannt ist. Dieser Ring dient als Gerüst für andere Teilungsproteine und zusammen bilden sie eine molekulare Maschinerie, die als Divisom bezeichnet wird. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Z-Ring hochdynamisch ist und dass sich FtsZ-Protofilamente durch Tretfräsen bewegen 4,5,6. Um den Z-Ring in Zeitrafferexperimenten zu untersuchen, ist es ratsam, die Teilungsstelle in der XY-Ebene aufzuzeichnen, um eine bessere Auflösung und eine schnelle Abtastung zu ermöglichen. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, vertikale Zellimmobilisierungsmethoden zu entwickeln, die üblicherweise die Nanofabrikation von Mikroloch-Zellfallen und komplexen mikrofluidischen Gerätenumfassen 7.
Cyanobakterien sind photosynthetische Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Zellmorphologie als gramnegativ klassifiziert werden. Phylogenetisch sind sie jedoch näher an grampositiven Bakterien8. Diese Organismen haben Zellteilungsgene, die in grampositiven und gramnegativen Bakterien üblich sind, aber ihr Divisom enthält auch einzigartige Elemente9. PCC 7120 (im Folgenden Anabaena sp.) ist ein filamentöses Cyanobakterium mit einer Teilungsebene und ist ein Modell für die Untersuchung der Zellteilung in mehrzelligen Cyanobakterien. Bei diesem Stamm ist es gelungen, die Positionierung von FtsZ in der Mitte der Zellen10 zu bestimmen. Dennoch gibt es keine Studien, die die in vivo Dynamik von FtsZ in diesem Modell zeigen. In unserem Labor haben wir durch triparentale Paarung und homologe Rekombination eine vollständig segregierte Mutante von Anabaena sp. erhalten, die das mit sfGFP fusionierte FtsZ-Protein exprimiert, das das komplette endogene ftsZ-Gen ersetzt. Wir haben eine schnelle und einfache Methode zur Zellimmobilisierung entwickelt, die die vertikale Ausrichtung der mutierten Stammfilamente für Zeitrafferexperimente bevorzugt, um die Teilungsproteine in filamentösen Cyanobakterien sichtbar zu machen. Diese Methode benötigt keine mikrofluidischen Geräte, die teuer und schwierig zu entwickeln sein können. Als Beispiel haben wir dieses Protokoll verwendet, um den Z-Ring in der FtsZ-sfGFP-Mutante durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung der Dynamik divisome Proteine ist zweifelsohne eine Herausforderung. Insbesondere bei filamentösen Cyanobakterien besteht eine der Herausforderungen in der Visualisierung des Z-Rings in der horizontalen Ebene, für die die Zellen vertikal ausgerichtet sein müssen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Positionierung des Z-Rings in der XY-Ebene, um die verschiedenen Analysen durchzuführen. Dies ist die erste einfache Methode für filamentöse Cyanobakterien, die eine vollständige Visualisierun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Nationalen Promotionsstipendien (ANID 21211333; 21191389) für die Finanzierung. Grant Fondecyt 1161232.
Diese Arbeit wurde von der Advanced Microscopy Facility UMA UC unterstützt.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
