用于体外研究的豚鼠圆窗膜移植
Summary
该协议概述了一种从豚鼠颞骨中移植圆窗膜的方法，为 离体 研究提供了宝贵的资源。
Abstract
高效和微创的药物输送到内耳是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）是内耳为数不多的入口点之一，已成为研究的重要焦点。然而，由于分离RWM的复杂性，我们对其药代动力学的理解仍然有限。RWM 由三个不同的层组成：外上皮层、中间结缔组织层和内上皮层，每个层都可能具有独特的递送特性。
目前用于研究跨 RWM 转运的模型利用依赖于细胞培养物或膜片段的体内动物模型或离体 RWM 模型。豚鼠是研究内耳内药物药代动力学的经过验证的临床前模型，也是耳蜗递送载体转化开发的重要动物模型。在这项研究中，我们描述了一种移植具有周围耳蜗骨的豚鼠 RWM 用于台式药物递送实验的方法。这种方法允许保留原生 RWM 架构，并且可以提供比当前台式模型更真实的运输障碍表示。
Introduction
已经出现了用于治疗感音神经性听力损失的新型疗法。这些疗法在临床人群的转化受到安全有效的内耳运输途径的限制。目前在动物研究中 的体内 递送方法依赖于开窗进入内耳或通过圆窗膜 （RWM） 扩散，圆窗膜是一种将中耳间隙与耳蜗分开的非骨屏障1。
手术开窗和显微注射到内耳都是侵入性的，可能会对残余内耳功能构成风险2.因此，RWM 是局部药物递送的重要途径，豚鼠是主要的临床前动物模型，用于研究 RWM 和内耳的局部药物药代动力学，用于药物开发 3,4。虽然比人类RWM更薄，但豚鼠RWM具有相同的三层结构。它的直径约为 1 mm，厚度为 15-25 μm，由夹在结缔组织层5 中的两个上皮细胞层组成。面向中耳的上皮层密集堆积，并通过紧密的连接连接，而面向内耳和鳞状鼓膜的层结构较松，没有明显的细胞间粘连。
目前调查豚鼠 RWM 药物渗透性的临床前研究依赖于体内中耳注射，然后对内耳内的外淋巴液进行采样，这不允许对 RWM 转运进行特异性研究 6,7。RWM 外植体的片段已用于临床前研究，但由于其脆弱性和小尺寸，它们不适合对需要跨 RWM2 的防水密封的药物和载体运输进行系统的微流体研究。其他研究小组使用培养的人上皮细胞的体外模型来近似RWM 8,9,10。然而，这些结构中的大多数只关注外上皮层，并没有捕捉到天然组织结构的复杂性。为了更详细地了解RWM的转运机制，需要有针对性的离体研究。
在这项研究中，我们展示了豚鼠 RWM 的移植与周围的骨支撑以保持膜完整性，并说明了它们在专为特定研究药物递送载体的 RWM 运输而设计的实验范式中的使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在局部药物递送至耳部时，RWM 是治疗药物到达内耳的主要途径。需要一个准确可靠的台式模型来更好地了解新型递送载体和药物开发的运输机制和渗透性。在这项研究中，我们证明了豚鼠 RWM 移植是一种可行且可靠的程序，可以对药物-膜相互作用进行系统研究。Lundman 等人和 Kelso 等人先前使用类似的 RWM 渗透率模型 2,16 进行了描述;然而，到目前为止，?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIDCD拨款编号1K08DC020780和5T32DC000027-33以及鲁宾斯坦听力研究基金的部分支持。
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
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