Membraanexplantatie van cavia's met rond venster voor ex vivo-onderzoek
Summary
Dit protocol schetst een methode voor de explantatie van het ronde venstermembraan uit slaapbeenderen van cavia’s, wat een waardevolle bron is voor ex vivo-studies .
Abstract
Efficiënte en minimaal invasieve medicijnafgifte aan het binnenoor is een grote uitdaging. Het ronde raammembraan (RWM), een van de weinige toegangspunten tot het binnenoor, is een essentieel aandachtspunt van onderzoek geworden. Vanwege de complexiteit van het isoleren van de RWM blijft ons begrip van de farmacokinetiek ervan echter beperkt. De RWM bestaat uit drie verschillende lagen: het buitenste epitheel, de middelste bindweefsellaag en de binnenste epitheellaag, die elk potentieel unieke afgifte-eigenschappen hebben.
De huidige modellen voor het onderzoeken van transport over de RWM maken gebruik van in vivo diermodellen of ex vivo RWM-modellen die gebaseerd zijn op celculturen of membraanfragmenten. Cavia’s dienen als een gevalideerd preklinisch model voor het onderzoek naar de farmacokinetiek van geneesmiddelen in het binnenoor en zijn een belangrijk diermodel voor de translationele ontwikkeling van toedieningsvoertuigen aan het slakkenhuis. In deze studie beschrijven we een aanpak voor explantatie van een cavia RWM met omringend cochleair bot voor benchtop medicijnafgifte-experimenten. Deze methode maakt het mogelijk om de oorspronkelijke RWM-architectuur te behouden en kan een realistischere weergave geven van transportbarrières dan de huidige benchtop-modellen.
Introduction
Er zijn nieuwe klassen van therapieën ontstaan voor de behandeling van perceptief gehoorverlies. De vertaling van deze therapieën naar klinische populaties wordt beperkt door veilige en effectieve transportroutes naar het binnenoor. De huidige methoden voor in vivo toediening in dierstudies zijn gebaseerd op fenestratie in het binnenoor of diffusie door het ronde venstermembraan (RWM), een niet-botvormige barrière die de middenoorruimte scheidt van het slakkenhuis.
Chirurgische fenestratie en micro-injectie in het binnenoor zijn beide invasief en kunnen risico’s opleveren voor de resterende binnenoorfunctie2. Daarom is de RWM een belangrijke route voor lokale medicijnafgifte, en cavia’s zijn het primaire preklinische diermodel dat wordt gebruikt om de lokale farmacokinetiek van geneesmiddelen in de RWM en in het binnenoor te bestuderen voor farmaceutische ontwikkeling 3,4. Hoewel dunner dan de menselijke RWM, deelt de cavia RWM een identieke drielaagse structuur. Het heeft een diameter van ongeveer 1 mm, is 15-25 μm dik en bestaat uit twee epitheelcellagen die een bindweefsellaag5 omklemmen. De epitheellaag die naar het middenoor is gericht, is dicht opeengepakt en verbonden via krappe verbindingen, terwijl de laag die naar het binnenoor en de scala tympani is gericht, een lossere architectuur heeft en geen significante intercellulaire verklevingen heeft.
Huidige preklinische studies naar de permeabiliteit van geneesmiddelen bij de cavia RWM zijn gebaseerd op in-vivo-injecties in het middenoor, gevolgd door de bemonstering van het perilymfevocht in het binnenoor, waardoor de specifieke studie van RWM-transport niet mogelijk is 6,7. Fragmenten van RWM-explantaten zijn gebruikt in preklinische studies, maar vanwege hun kwetsbaarheid en kleine formaat zijn ze niet geschikt voor systematisch, microfluïdisch onderzoek van het transport van geneesmiddelen en voertuigen waarvoor een waterdichte afsluiting over de RWM2 nodig is. Andere groepen hebben in vitro modellen met gekweekte menselijke epitheelcellen gebruikt om de RWM 8,9,10 te benaderen. De meeste van deze constructen richten zich echter uitsluitend op de buitenste epitheellaag en leggen de complexiteit van de oorspronkelijke weefselarchitectuur niet vast. Voor een gedetailleerder inzicht in de transportmechanismen in het RWM zijn gerichte, ex vivo studies nodig.
In deze studie demonstreren we de explantatie van een RWM van een cavia met omringende benige ondersteuning om de integriteit van het membraan te behouden en illustreren we hun gebruik in een experimenteel paradigma dat is ontworpen voor de specifieke studie van het RWM-transport van voertuigen voor medicijnafgifte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij lokale medicijnafgifte aan het oor is de RWM de primaire doorgangsroute voor therapieën om het binnenoor te bereiken. Een nauwkeurig en betrouwbaar benchtop-model is nodig om transportmechanismen en permeabiliteit tussen nieuwe leveringsvoertuigen en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen beter te begrijpen. In deze studie tonen we aan dat RWM-explantatie bij cavia’s een haalbare en betrouwbare procedure is om systematisch onderzoek naar geneesmiddel-membraaninteracties mogelijk te maken. Lundman et al. en Kelso et…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIDCD-subsidies nr. 1K08DC020780 en 5T32DC000027-33, en het Rubenstein Hearing Research Fund.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
Riferimenti
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
