Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Summary

Este protocolo descreve um método para o explante da membrana da janela redonda de ossos temporais de cobaias, fornecendo um recurso valioso para estudos ex vivo .

Abstract

A liberação eficiente e minimamente invasiva de fármacos na orelha interna é um grande desafio. A membrana da janela redonda (MRP), sendo um dos poucos pontos de entrada para a orelha interna, tornou-se um foco vital de investigação. No entanto, devido às complexidades do isolamento do RWM, nossa compreensão de sua farmacocinética permanece limitada. O RWM compreende três camadas distintas: o epitélio externo, a camada média de tecido conjuntivo e a camada epitelial interna, cada uma potencialmente possuindo propriedades de liberação únicas.

Os modelos atuais para investigar o transporte através do RWM utilizam modelos animais in vivo ou modelos RWM ex vivo que dependem de culturas de células ou fragmentos de membrana. As cobaias servem como um modelo pré-clínico validado para a investigação da farmacocinética de drogas na orelha interna e são um modelo animal importante para o desenvolvimento translacional de veículos de entrega para a cóclea. Neste estudo, descrevemos uma abordagem para explante de uma cobaia RWM com osso coclear circundante para experimentos de liberação de fármacos em bancada. Este método permite a preservação da arquitetura RWM nativa e pode fornecer uma representação mais realista das barreiras ao transporte do que os modelos atuais de bancada.

Introduction

Novas classes de terapêuticas têm surgido para o tratamento da perda auditiva neurossensorial. A tradução dessas terapêuticas para populações clínicas é limitada por vias seguras e eficazes de transporte para a orelha interna. Os métodos atuais de liberação in vivo em estudos com animais baseiam-se tanto na fenestração para a orelha interna quanto na difusão através da membrana da janela redonda (MRP), uma barreira não óssea que separa o espaço da orelha média da cóclea1.

A fenestração cirúrgica e a microinjeção na orelha interna são invasivas e podem representar riscos à função residual da orelha interna². Portanto, a RWM é uma importante via para liberação local de fármacos, e as cobaias são o principal modelo animal pré-clínico utilizado para estudar a farmacocinética local de fármacos em toda a RWM e na orelha interna para o desenvolvimento farmacêutico ^3,4. Embora mais fina que a RWM humana, a cobaia RWM compartilha uma estrutura idêntica de três camadas. Tem aproximadamente 1 mm de diâmetro, 15-25 μm de espessura e é composto por duas camadas de células epiteliais que formam uma camada de tecido conjuntivo⁵. A camada epitelial voltada para a orelha média é densamente compactada e conectada através de tight junctions, enquanto a camada voltada para a orelha interna e escala timpânica tem arquitetura mais frouxa e não tem aderências intercelulares significativas.

Os estudos pré-clínicos atuais que investigam a permeabilidade de drogas na cobaia RWM baseiam-se em injeções in vivo na orelha média seguidas da amostragem do fluido da perilinfa dentro da orelha interna, o que não permite o estudo específico do transporte da RMP ^6,7. Fragmentos de explantes RWM têm sido usados em estudos pré-clínicos, mas devido à sua fragilidade e pequeno tamanho, eles não são adequados para investigações microfluídicas sistemáticas de transporte de drogas e veículos que requerem uma vedação estanque em todo o RWM². Outros grupos empregaram modelos in vitro com cultura de células epiteliais humanas para aproximar o RWM ^8,9,10. No entanto, a maioria desses construtos focaliza apenas a camada epitelial externa e não captura a complexidade da arquitetura do tecido nativo. Para uma compreensão mais detalhada dos mecanismos de transporte através do RWM, são necessários estudos ex vivo direcionados.

Neste estudo, demonstramos o explante de uma cobaia RWM com suporte ósseo circundante para preservar a integridade da membrana e ilustramos seu uso em um paradigma experimental desenhado para o estudo específico do transporte RWM de veículos de entrega de drogas.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (GP18M226). Cobaias albinas Hartley (machos e fêmeas, pesando 500-700 g) foram utilizadas no presente estudo. 1. Configuração e preparação do procedimento Esterilizar todos os instrumentos com óxido de etileno antes de iniciar o experimento. Eutanásia dos animais seguindo protocolo aprovado institucionalmente.NOTA: No presente estudo, uma c?…

Representative Results

Como demonstrado na Figura 3A, este método permite o explante da membrana da janela redonda intacta da cobaia com um anel de osso rígido circundante. A RMP deve estar totalmente conectada circunferencialmente ao anel ósseo. Nenhuma fratura do osso coclear deve ser apreciada. Em comparação com espécimes humanos de janela redonda, a cobaia RWM não tem uma pseudomembrana sobrejacente. Além disso, ao contrário dos seres humanos, existe uma ponte óssea entre as cruras do estribo da coba…

Discussion

Na administração local da droga para a orelha, a RWM é a principal via de passagem para a terapêutica chegar à orelha interna. Um modelo de bancada preciso e confiável é necessário para entender melhor os mecanismos de transporte e a permeabilidade em novos veículos de entrega e para o desenvolvimento de medicamentos. Neste estudo, demonstramos que o explante de RMP em cobaias é um procedimento viável e confiável para permitir investigações sistemáticas de interações fármaco-membrana. e Kelso et al., ut…

Materials

1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST