Espianto di membrane a finestra rotonda di porcellini d'India per studi ex vivo
Summary
Questo protocollo delinea un metodo per l’espianto della membrana della finestra rotonda dalle ossa temporali dei porcellini d’India, fornendo una risorsa preziosa per gli studi ex vivo .
Abstract
La somministrazione efficiente e minimamente invasiva dei farmaci all’orecchio interno è una sfida significativa. La membrana a finestra rotonda (RWM), essendo uno dei pochi punti di ingresso all’orecchio interno, è diventata un punto focale di indagine. Tuttavia, a causa della complessità dell’isolamento dell’RWM, la nostra comprensione della sua farmacocinetica rimane limitata. L’RWM comprende tre strati distinti: l’epitelio esterno, lo strato intermedio di tessuto connettivo e lo strato epiteliale interno, ciascuno dei quali possiede proprietà di rilascio uniche.
Gli attuali modelli per studiare il trasporto attraverso l’RWM utilizzano modelli animali in vivo o modelli RWM ex vivo che si basano su colture cellulari o frammenti di membrana. I porcellini d’India fungono da modello preclinico validato per lo studio della farmacocinetica dei farmaci all’interno dell’orecchio interno e sono un importante modello animale per lo sviluppo traslazionale di veicoli di somministrazione alla coclea. In questo studio, descriviamo un approccio per l’espianto di un RWM di cavia con osso cocleare circostante per esperimenti di somministrazione di farmaci da banco. Questo metodo consente di preservare l’architettura RWM nativa e può fornire una rappresentazione più realistica delle barriere al trasporto rispetto agli attuali modelli da banco.
Introduction
Sono emerse nuove classi di terapie per il trattamento dell’ipoacusia neurosensoriale. La traduzione di queste terapie nelle popolazioni cliniche è limitata da vie di trasporto sicure ed efficaci nell’orecchio interno. Gli attuali metodi di somministrazione in vivo negli studi sugli animali si basano sulla fenestrazione nell’orecchio interno o sulla diffusione attraverso la membrana a finestra rotonda (RWM), una barriera non ossea che separa lo spazio dell’orecchio medio dalla coclea1.
La fenestrazione chirurgica e la microiniezione nell’orecchio interno sono entrambe invasive e possono comportare rischi per la funzione residua dell’orecchio interno2. Pertanto, l’RWM è una via importante per la somministrazione locale di farmaci e le cavie sono il principale modello animale preclinico utilizzato per studiare la farmacocinetica dei farmaci locali attraverso l’RWM e nell’orecchio interno per lo sviluppo farmaceutico 3,4. Sebbene più sottile dell’RWM umano, il porcellino d’India RWM condivide un’identica struttura a tre strati. Ha un diametro di circa 1 mm, uno spessore di 15-25 μm ed è composto da due strati di cellule epiteliali che racchiudono uno strato di tessuto connettivo5. Lo strato epiteliale rivolto verso l’orecchio medio è densamente impacchettato e collegato tramite giunzioni strette, mentre lo strato rivolto verso l’orecchio interno e la scala timpanica ha un’architettura più sciolta e non ha aderenze intercellulari significative.
Gli attuali studi preclinici che indagano la permeabilità ai farmaci nella RWM cavia si basano su iniezioni in vivo nell’orecchio medio seguite dal campionamento del liquido perilinfatico all’interno dell’orecchio interno, il che non consente lo studio specifico del trasporto RWM 6,7. Frammenti di espianti RWM sono stati utilizzati in studi preclinici, ma a causa della loro fragilità e delle loro piccole dimensioni, non sono adatti per indagini microfluidiche sistematiche sul trasporto di farmaci e veicoli che richiedono una tenuta stagna attraverso l’RWM2. Altri gruppi hanno impiegato modelli in vitro con cellule epiteliali umane in coltura per approssimare l’RWM 8,9,10. Tuttavia, la maggior parte di questi costrutti si concentra esclusivamente sullo strato epiteliale esterno e non cattura la complessità dell’architettura del tessuto nativo. Per una comprensione più dettagliata dei meccanismi di trasporto attraverso l’RWM, sono necessari studi mirati ex vivo.
In questo studio, dimostriamo l’espianto di un RWM di cavia con supporto osseo circostante per preservare l’integrità della membrana e illustriamo il loro utilizzo in un paradigma sperimentale progettato per lo studio specifico del trasporto RWM di veicoli per la somministrazione di farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella somministrazione locale di farmaci all’orecchio, l’RWM è la principale via di passaggio per le terapie per raggiungere l’orecchio interno. È necessario un modello da banco accurato e affidabile per comprendere meglio i meccanismi di trasporto e la permeabilità attraverso i nuovi veicoli di somministrazione e per lo sviluppo di farmaci. In questo studio, dimostriamo che l’espianto di RWM da cavia è una procedura fattibile e affidabile per consentire indagini sistematiche sulle interazioni farmaco-membrana. Lundm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIDCD n. 1K08DC020780 e 5T32DC000027-33 e dal Rubenstein Hearing Research Fund.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
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