Bu protokol, kobay temporal kemiklerinden yuvarlak pencere zarının eksplantasyonu için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir ve ex vivo çalışmalar için değerli bir kaynak sağlar.
İç kulağa etkili ve minimal invaziv ilaç iletimi önemli bir zorluktur. İç kulağa birkaç giriş noktasından biri olan yuvarlak pencere membranı (RWM), araştırmaların hayati bir odağı haline gelmiştir. Bununla birlikte, RWM’yi izole etmenin karmaşıklığı nedeniyle, farmakokinetiği hakkındaki anlayışımız sınırlı kalmaktadır. RWM üç farklı katmandan oluşur: dış epitel, orta bağ dokusu katmanı ve iç epitel katmanı, her biri potansiyel olarak benzersiz dağıtım özelliklerine sahiptir.
RWM boyunca taşınmayı araştırmak için mevcut modeller, hücre kültürlerine veya membran parçalarına dayanan in vivo hayvan modellerini veya ex vivo RWM modellerini kullanır. Gine domuzları, iç kulaktaki ilaç farmakokinetiğinin araştırılması için doğrulanmış bir klinik öncesi model olarak hizmet eder ve kokleaya dağıtım araçlarının translasyonel gelişimi için önemli bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, bir kobay RWM’nin tezgah üstü ilaç salım deneyleri için çevresindeki koklear kemik ile eksplantasyonuna yönelik bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem, yerel RWM mimarisinin korunmasına izin verir ve mevcut tezgah üstü modellere göre taşıma engellerinin daha gerçekçi bir temsilini sağlayabilir.
Sensörinöral işitme kaybının tedavisi için yeni terapötik sınıflar ortaya çıkmıştır. Bu terapötiklerin klinik popülasyonlara çevrilmesi, iç kulağa güvenli ve etkili taşıma yolları ile sınırlıdır. Hayvan çalışmalarında mevcut in vivo uygulama yöntemleri, ya iç kulağa fenestrasyona ya da orta kulak boşluğunu kokleadan ayıran kemik olmayan bir bariyer olan yuvarlak pencere zarından (RWM) difüzyona dayanır1.
Cerrahi pencere ve iç kulağa mikroenjeksiyon hem invazivdir hem de rezidüel iç kulak fonksiyonu için risk oluşturabilir2. Bu nedenle, RWM, yerel ilaç dağıtımı için önemli bir yoldur ve kobaylar, farmasötik geliştirme için RWM boyunca ve iç kulakta yerel ilaç farmakokinetiğini incelemek için kullanılan birincil klinik öncesi hayvan modelidir 3,4. İnsan RWM’sinden daha ince olmasına rağmen, kobay RWM aynı üç katmanlı yapıyı paylaşır. Yaklaşık 1 mm çapında, 15-25 μm kalınlığındadır ve bir bağ dokusu tabakasını5 sandviçleyen iki epitel hücre tabakasından oluşur. Orta kulağa bakan epitel tabakası yoğun bir şekilde paketlenir ve sıkı bağlantılarla bağlanırken, iç kulağa bakan tabaka ve skala timpani daha gevşek bir mimariye sahiptir ve önemli hücreler arası yapışıklıklara sahip değildir.
Kobay RWM’de ilaç geçirgenliğini araştıran mevcut klinik öncesi çalışmalar, in vivo orta kulak enjeksiyonlarına ve ardından iç kulaktaki perilenf sıvısının örneklenmesine dayanmaktadır, bu da RWM transportunun spesifik çalışmasına izin vermemektedir 6,7. RWM eksplantlarının fragmanları klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır, ancak kırılganlıkları ve küçük boyutları nedeniyle, RWM2 boyunca su geçirmez bir sızdırmazlık gerektiren ilaç ve araç taşımacılığının sistematik, mikroakışkan araştırmaları için uygun değildirler. Diğer gruplar, RWM 8,9,10’a yaklaşmak için kültürlenmiş insan epitel hücreleri ile in vitro modeller kullanmışlardır. Bununla birlikte, bu yapıların çoğu yalnızca dış epitel tabakasına odaklanır ve doğal doku mimarisinin karmaşıklığını yakalamaz. RWM boyunca taşıma mekanizmalarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması için, hedefli, ex vivo çalışmalar gereklidir.
Bu çalışmada, membran bütünlüğünü korumak için bir kobay RWM’nin çevreleyen kemik desteği ile eksplantasyonunu gösteriyoruz ve ilaç dağıtım araçlarının RWM taşınmasının spesifik çalışması için tasarlanmış deneysel bir paradigmada kullanımlarını gösteriyoruz.
Kulağa lokal ilaç dağıtımında, RWM, terapötiklerin iç kulağa ulaşması için birincil geçiş yoludur. Yeni dağıtım araçlarında taşıma mekanizmalarını ve geçirgenliği daha iyi anlamak ve ilaç geliştirme için doğru ve güvenilir bir tezgah üstü modele ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kobay RWM eksplantasyonunun, ilaç-membran etkileşimlerinin sistematik olarak araştırılmasına izin vermek için uygulanabilir ve güvenilir bir prosedür olduğunu gösterdik. Lundman ve ark. ve Kelso ve ark….
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen NIDCD Hibeleri No. 1K08DC020780 ve 5T32DC000027-33 ve Rubenstein İşitme Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.
1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |