Explantation de membrane de fenêtre ronde de cobaye pour études ex vivo
Summary
Ce protocole décrit une méthode d’explantation de la membrane de la fenêtre ronde des os temporaux de cobaye, fournissant une ressource précieuse pour les études ex vivo .
Abstract
L’administration efficace et peu invasive de médicaments dans l’oreille interne est un défi de taille. La membrane de fenêtre ronde (RWM), étant l’un des rares points d’entrée de l’oreille interne, est devenue un centre de recherche essentiel. Cependant, en raison de la complexité de l’isolement du RWM, notre compréhension de sa pharmacocinétique reste limitée. Le RWM comprend trois couches distinctes : l’épithélium externe, la couche de tissu conjonctif moyen et la couche épithéliale interne, chacune possédant potentiellement des propriétés d’administration uniques.
Les modèles actuels d’étude du transport à travers le RWM utilisent des modèles animaux in vivo ou des modèles RWM ex vivo qui reposent sur des cultures cellulaires ou des fragments de membrane. Les cobayes servent de modèle préclinique validé pour l’étude de la pharmacocinétique des médicaments dans l’oreille interne et constituent un modèle animal important pour le développement translationnel des véhicules d’administration à la cochlée. Dans cette étude, nous décrivons une approche d’explantation d’un RWM de cobaye avec l’os cochléaire environnant pour des expériences d’administration de médicaments sur paillasse. Cette méthode permet de préserver l’architecture RWM native et peut fournir une représentation plus réaliste des obstacles au transport que les modèles de paillasse actuels.
Introduction
De nouvelles classes de traitements ont vu le jour pour le traitement de la perte auditive neurosensorielle. L’application de ces thérapies aux populations cliniques est limitée par des voies de transport sûres et efficaces dans l’oreille interne. Les méthodes actuelles d’administration in vivo dans les études animales reposent soit sur la fenestration dans l’oreille interne, soit sur la diffusion à travers la membrane de la fenêtre ronde (RWM), une barrière non osseuse qui sépare l’espace de l’oreille moyenne de la cochlée1.
La fenestration chirurgicale et la micro-injection dans l’oreille interne sont toutes deux invasives et peuvent présenter des risques pour la fonction résiduelle de l’oreille interne2. Par conséquent, le RWM est une voie importante pour l’administration locale des médicaments, et les cobayes sont le principal modèle animal préclinique utilisé pour étudier la pharmacocinétique locale des médicaments dans le RWM et dans l’oreille interne pour le développement pharmaceutique 3,4. Bien que plus mince que le RWM humain, le RWM du cobaye partage une structure identique à trois couches. Il mesure environ 1 mm de diamètre, 15 à 25 μm d’épaisseur et est composé de deux couches de cellules épithéliales prenant en sandwich une couche de tissu conjonctif5. La couche épithéliale faisant face à l’oreille moyenne est densément tassée et reliée par des jonctions serrées, tandis que la couche faisant face à l’oreille interne et à la rampe tympanique a une architecture plus lâche et n’a pas d’adhérences intercellulaires significatives.
Les études précliniques actuelles portant sur la perméabilité aux médicaments chez le cobaye RWM reposent sur des injections in vivo dans l’oreille moyenne suivies d’un prélèvement du liquide périlymphatique dans l’oreille interne, ce qui ne permet pas l’étude spécifique du transport RWM 6,7. Des fragments d’explants de RWM ont été utilisés dans des études précliniques, mais en raison de leur fragilité et de leur petite taille, ils ne conviennent pas aux études microfluidiques systématiques du transport de médicaments et de véhicules nécessitant une étanchéité à travers le RWM2. D’autres groupes ont utilisé des modèles in vitro avec des cellules épithéliales humaines en culture pour approximer le RWM 8,9,10. Cependant, la majorité de ces constructions se concentrent uniquement sur la couche épithéliale externe et ne capturent pas la complexité de l’architecture tissulaire native. Pour une compréhension plus détaillée des mécanismes de transport dans l’ensemble de la RWM, des études ex vivo ciblées sont nécessaires.
Dans cette étude, nous démontrons l’explantation d’un RWM de cobaye avec un support osseux environnant pour préserver l’intégrité de la membrane et illustrons leur utilisation dans un paradigme expérimental conçu pour l’étude spécifique du transport RWM des véhicules d’administration de médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans l’administration locale de médicaments à l’oreille, le RWM est la principale voie de passage pour que les thérapies atteignent l’oreille interne. Un modèle de paillasse précis et fiable est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes de transport et la perméabilité à travers les nouveaux véhicules d’administration et pour le développement de médicaments. Dans cette étude, nous démontrons que l’explantation RWM de cobaye est une procédure réalisable et fiable pour permettre des études …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les subventions NIDCD n° 1K08DC020780 et 5T32DC000027-33, et le Fonds de recherche sur l’audition Rubenstein.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
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