Ex Vivo 연구를 위한 기니피그 원형 창 멤브레인 이식
Summary
이 프로토콜은 기니피그 측두골에서 둥근 창막을 이식하는 방법을 설명하여 생체 외 연구에 귀중한 리소스를 제공합니다.
Abstract
내이에 대한 효율적이고 최소 침습적 약물 전달은 중요한 과제입니다. 내이로 들어가는 몇 안 되는 진입점 중 하나인 둥근 창막(RWM)은 연구의 중요한 초점이 되었습니다. 그러나 RWM을 분리하는 것이 복잡하기 때문에 약동학에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. RWM은 외부 상피, 중간 결합 조직층 및 내부 상피층의 세 가지 별개의 층으로 구성되며, 각 층은 잠재적으로 고유한 전달 특성을 가지고 있습니다.
RWM을 통한 수송을 조사하기 위한 현재 모델은 세포 배양 또는 막 조각에 의존하는 생체 내 동물 모델 또는 생체 외 RWM 모델을 활용합니다. 기니피그는 내이 내 약물 약동학 조사를 위한 검증된 전임상 모델 역할을 하며, 달팽이관에 대한 전달 수단의 중개 개발을 위한 중요한 동물 모델입니다. 이 연구에서는 벤치탑 약물 전달 실험을 위해 주변 달팽이관과 함께 기니피그 RWM을 이식하는 접근 방식을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 기본 RWM 아키텍처를 보존할 수 있으며 현재 벤치탑 모델보다 운송 장벽을 보다 사실적으로 표현할 수 있습니다.
Introduction
감각신경성 난청 치료를 위한 새로운 종류의 치료법이 등장했습니다. 이러한 치료제를 임상 인구에 적용하는 것은 내이로 운반하는 안전하고 효과적인 경로에 의해 제한됩니다. 동물 연구에서 현재 생체 내 전달 방법은 내이로의 창호 또는 달팽이관에서 중이 공간을 분리하는 비골 장벽인 둥근 창막(RWM)을 통한 확산에 의존합니다1.
외과적 창호와 내이에 대한 미세 주입은 모두 침습적이며 잔류 내이 기능에 위험을 초래할 수 있다2. 따라서 RWM은 국소 약물 전달을 위한 중요한 경로이며, 기니피그는 RWM 전체와 의약품 개발을 위한 내이의 국소 약물 약동학을 연구하는 데 사용되는 주요 전임상 동물 모델입니다 3,4. 기니피그 RWM은 인간 RWM보다 얇지만 동일한 3층 구조를 공유합니다. 직경 약 1mm, 두께 15-25μm이며, 결합 조직층(5)을 끼우는 두 개의 상피 세포층으로 구성되어 있습니다. 중이를 향하는 상피층은 조밀하게 밀집되어 있고 단단한 접합부를 통해 연결되어 있는 반면, 내이와 스칼라 고막을 향하는 층은 구조가 느슨하고 세포 간 유착이 크지 않습니다.
기니피그 RWM의 약물 투과성을 조사하는 현재의 전임상 연구는 생체 내 중이 주사 후 내이 내 림프액 샘플링에 의존하고 있으며, 이는 RWM 수송에 대한 특정 연구를 허용하지 않습니다 6,7. RWM 외식의 단편은 전임상 연구에 사용되어 왔지만, 취약성과 작은 크기로 인해 RWM2 전체에 걸쳐 방수 밀봉이 필요한 약물 및 차량 운송의 체계적인 미세유체 조사에는 적합하지 않습니다. 다른 그룹은 RWM 8,9,10에 근접하기 위해 배양된 인간 상피 세포가 있는 시험관 내 모델을 사용했습니다. 그러나 이러한 구조의 대부분은 외부 상피층에만 초점을 맞추고 자연 조직 구조의 복잡성을 포착하지 못합니다. RWM 전반의 수송 메커니즘에 대한 보다 자세한 이해를 위해서는 표적화된 체외 연구가 필요합니다.
이 연구에서는 막 무결성을 보존하기 위해 주변 뼈 지지대와 함께 기니피그 RWM을 이식하는 방법을 시연하고 약물 전달 차량의 RWM 수송에 대한 특정 연구를 위해 설계된 실험 패러다임에서 RWM의 사용을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
귀에 국소 약물 전달에서 RWM은 치료제가 내이에 도달하는 주요 통로입니다. 정확하고 신뢰할 수 있는 벤치탑 모델은 새로운 전달 차량 전반에 걸친 운송 메커니즘과 투과성을 더 잘 이해하고 약물 개발을 위해 필요합니다. 이 연구에서 우리는 기니피그 RWM 이식이 약물-막 상호 작용에 대한 체계적인 조사를 가능하게 하는 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 절차임을 보여줍니다. Lundman et al. 및 Kelso et a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIDCD 보조금 번호 1K08DC020780 및 5T32DC000027-33과 Rubenstein Hearing Research Fund의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
Riferimenti
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
