Explantación de membrana de ventana redonda de conejillo de indias para estudios ex vivo
Summary
Este protocolo describe un método para la explantación de la membrana de ventana redonda de huesos temporales de conejillos de indias, proporcionando un recurso valioso para estudios ex vivo .
Abstract
La administración eficiente y mínimamente invasiva de fármacos al oído interno es un desafío importante. La membrana de ventana redonda (RWM), al ser uno de los pocos puntos de entrada al oído interno, se ha convertido en un foco vital de investigación. Sin embargo, debido a las complejidades de aislar el RWM, nuestra comprensión de su farmacocinética sigue siendo limitada. El RWM comprende tres capas distintas: el epitelio externo, la capa de tejido conectivo medio y la capa epitelial interna, cada una de las cuales posee propiedades de administración únicas.
Los modelos actuales para investigar el transporte a través de la RWM utilizan modelos animales in vivo o modelos RWM ex vivo que se basan en cultivos celulares o fragmentos de membrana. Los conejillos de indias sirven como un modelo preclínico validado para la investigación de la farmacocinética de fármacos en el oído interno y son un modelo animal importante para el desarrollo traslacional de vehículos de administración a la cóclea. En este estudio, describimos un enfoque para la explantación de un RWM de conejillo de indias con hueso coclear circundante para experimentos de administración de fármacos en el laboratorio. Este método permite la preservación de la arquitectura RWM nativa y puede proporcionar una representación más realista de las barreras al transporte que los modelos de sobremesa actuales.
Introduction
Han surgido nuevas clases de terapias para el tratamiento de la pérdida auditiva neurosensorial. La traslación de estas terapias a poblaciones clínicas está limitada por rutas seguras y eficaces de transporte al oído interno. Los métodos actuales de administración in vivo en estudios con animales se basan en la fenestración en el oído interno o en la difusión a través de la membrana de ventana redonda (RWM), una barrera no ósea que separa el espacio del oído medio de la cóclea1.
La fenestración quirúrgica y la microinyección en el oído interno son invasivas y pueden presentar riesgos para la función residual del oído interno2. Por lo tanto, la RWM es una ruta importante para la administración local de fármacos, y los conejillos de indias son el principal modelo animal preclínico utilizado para estudiar la farmacocinética local de fármacos en la RWM y en el oído interno para el desarrollo farmacéutico 3,4. Aunque es más delgado que el RWM humano, el conejillo de indias RWM comparte una estructura idéntica de tres capas. Tiene aproximadamente 1 mm de diámetro, 15-25 μm de espesor y está compuesto por dos capas de células epiteliales que intercalan una capa de tejido conectivo5. La capa epitelial que se enfrenta al oído medio está densamente empaquetada y conectada a través de uniones estrechas, mientras que la capa que se enfrenta al oído interno y al escalón del tímpano tiene una arquitectura más laxa y no tiene adherencias intercelulares significativas.
Los estudios preclínicos actuales que investigan la permeabilidad del fármaco en el RWM del conejillo de indias se basan en inyecciones in vivo en el oído medio seguidas de la toma de muestras del líquido perilinfático dentro del oído interno, lo que no permite el estudio específico del transporte de RWM 6,7. Los fragmentos de explantes de RWM se han utilizado en estudios preclínicos, pero debido a su fragilidad y pequeño tamaño, no son adecuados para investigaciones sistemáticas y microfluídicas de transporte de fármacos y vehículos que requieran un sello hermético a través del RWM2. Otros grupos han empleado modelos in vitro con células epiteliales humanas cultivadas para aproximarse a la RWM 8,9,10. Sin embargo, la mayoría de estas construcciones se centran únicamente en la capa epitelial externa y no capturan la complejidad de la arquitectura de los tejidos nativos. Para una comprensión más detallada de los mecanismos de transporte a través de la RWM, se requieren estudios ex vivo específicos.
En este estudio, demostramos la explantación de un RWM de cobaya con soporte óseo circundante para preservar la integridad de la membrana e ilustramos su uso en un paradigma experimental diseñado para el estudio específico del transporte de RWM de vehículos de administración de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la administración local de fármacos al oído, la RWM es la principal vía de paso para que la terapéutica llegue al oído interno. Se necesita un modelo de sobremesa preciso y fiable para comprender mejor los mecanismos de transporte y la permeabilidad a través de nuevos vehículos de administración y para el desarrollo de fármacos. En este estudio, demostramos que la explantación de RWM de cobaya es un procedimiento factible y confiable para permitir investigaciones sistemáticas de las interacciones fármaco-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones del NIDCD No. 1K08DC020780 y 5T32DC000027-33, y el Fondo de Investigación Auditiva Rubenstein.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
Riferimenti
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
