Summary
内皮细胞集落形成祖细胞（ECFCs）是一种很有前途的的工具来研究血管稳态和维修。
Abstract
本文介绍了一个新颖的恢复策略，对内皮细胞集落形成祖细胞肝素（ECFCs），但在其他unmanipulated成人外周血内，平均12天。 > 1 × 10 8 ECFCs大规模扩张后可以得到进一步的测试。有利的是，通过使用pHPL人体细胞与牛血清抗原的接触可以被排除在外。通过流式细胞仪和免疫组化分离的细胞可以被定性为ECFC 和他们在体外的功能，形成像血管结构，可在基质胶实验测试。这些细胞可皮下注射的小鼠模型，以形成功能， 在体内血管灌注。经过长期的扩张和冷冻保存扩散，功能和基因组的稳定性出现3,4予以保留。
这种动物蛋白的隔离和扩展方法是很容易适用于生成大量的ECFCs。
Protocol
A）ECFC ISOLATON
第一天：
- 之前，请先准备实验的细胞培养液中血管内皮生长培养基- 2（EGM - 2）。补充500毫升内皮细胞基础培养基与肝素（000 U / ml的1毫升）2，青霉素/链霉素100X 5ml的解决方案（所有Sigma公司，圣路易斯，密苏里州; www.sigmaaldrich.com ），L -谷氨酰胺（终浓度为2毫米），并汇集人类血小板裂解液（pHPL）50毫升。然后添加2毫升hFGF - B的，氢化可的松0.2毫升，0.5毫升血管内皮生长因子，0.5毫升表皮生长因子，IGF - 1和0.5毫升的抗坏血酸（如SingleQuots提供0.5毫升，所有龙沙，Walkersville，MD ; http://www.lonzabioscience 。 COM / ）。无菌滤液通过一个0.2米孔径大小500毫升Millipore公司真空过滤介质。由于pHPL形成小血块，您可能需要一个中型的两个过滤器。预温过滤临时股东大会，2至37 ° C水浴中
- 收集到一个6毫升不含防腐剂钠肝素血液真空采血管管从肘静脉成人外周血5毫升的血液样本。最大的两个小时内，你应该处理的血液样本。
- 开始准备一个75厘米的2（T75;中光学）一个通风帽，一个25毫升吸管和两个5毫升移液器在层流台的容量瓶中。
- 预填充15毫升预热补充到烧瓶中，用25毫升吸管EGM - 2。现在打开血小瓶样品所有5毫升5毫升吸管入烧瓶。空血小瓶5毫升额外EGM - 2的第二个5毫升吸管冲洗。 T75内的总体积为25毫升。关闭通风帽的容量瓶中，并在孵化器的地方，在37℃，5％CO 2和95％湿度为24小时。
第2天：
- 经过约24小时（过夜），你应该删除中期血的混合物，除去非贴壁细胞。对于这个准备两个25毫升移液管和层流三个5毫升移液器，预温20毫升至37 ° C水浴中补充EGM - 2）和（前一天准备30毫升PBS。
- 从培养箱取出样品的容量瓶中，并删除所有与25毫升吸管的上清液。小心不要划伤烧瓶的表面，避免损坏任何潜在的殖民地。内瓶细胞黏附表面洗净，轻轻地从一个侧面添加10毫升预热PBS和倾斜烧瓶其他三次。取出PBS立即每次和丢弃。
- 添加20毫升的新鲜预热EGM - 2的烧瓶中，放入孵化器。这个过程应该是尽可能快，尽可能温柔的贴壁细胞不分离。 ECFCs分离容易，如果他们是在PBS或在室温下保持长期。
- 通过烧瓶屏幕系统每隔一天一天两起使用低倍率轻显微镜寻找ECFC产物。当一个殖民地被发现在上面标记的指示殖民地的地位瓶的外侧。注意的flaks不应超过5分钟外的孵化器。
第5天：
- 在播种后第五天执行一个完整的介质变化，除去非贴壁细胞。为此预温20毫升EGM - 2至37 ° C水浴中，并准备两个25毫升移液器。
- 用25毫升吸管取出完全培养基，并添加新鲜，预热补充EGM - 2尽快。细胞不应该没有超过一分钟，以避免干燥介质。进入孵化器的地方回来，每天重复筛查烧瓶。
- 饲料中的细胞更换新鲜补充EGM - 2每周两次30％的中等。
日14-28：
- 鹅卵石形态的典型菌落出现12天左右。马克烧瓶上方的外侧，表明每个殖民地的位置。允许的殖民地，直到第28天增长，除非单细胞开始分离。有一次，小学殖民地已经确定，他们可以收获14和28天之间，这取决于它们的大小。
B.）ECFC收获
- 预温5毫升胰蛋白酶0.05％/ EDTA，20毫升PBS和5毫升新鲜补充EGM - 2。
- 彻底清除介质从烧瓶成猎鹰管（小心不要触摸表面的容量瓶中，以避免损坏任何潜在的殖民地），仔细用10 ml预热的PBS洗细胞。
- 在孵化器5分钟，加入5毫升胰蛋白酶/ EDTA和孵化。细胞不应超过7分钟的暴露，就变成有毒的胰蛋白酶，因为。彻底攻烧瓶双方，有利于细胞分离。淬火加入约10毫升的保留使用的培养基的胰蛋白酶蛋白酶活性。
- 删除到50毫升法尔科的细胞悬液n管。洗烧瓶曾经用10 ml PBS，这是以后添加到收获的细胞悬液。离心细胞悬液300克7日在4分钟° C至收集细胞并去除胰蛋白酶。弃上清，并立即在1毫升PBS重悬细胞沉淀。置于冰上。
- 确定细胞数量在朱庇特的协议，由R.李嘉图和K. Phelani 5。
C）ECFC扩展
- 补充500毫升EGM - 2在1.1中所述）。预温至37℃，水浴。
- 对于约2500平方厘米的文化空间，准备一个为11 T220（225 厘米2）或15 T175（175 厘米 2）或一个四层次的细胞工厂（CF - 4; NUNC，Naperville的，IL ; http://www.nuncbrand COM ）。此外，您将需要两个新鲜通风帽和一个特殊的无菌层流台漏斗。
- 要在起始细胞密度为100种子ECFCs C /厘米2的细胞数的计算是必要的。对于一个CF - 4 252800细胞悬浮在500毫升的新鲜EGM - 2，浇成的CF - 4使用无菌漏斗。关闭排气第一个发泄的CF - 4一个经度一侧倾斜，使媒介之间的所有4个面粉的平等分配。然后倾斜室和开放式排气帽盖。放置在孵化器CF - 4。
- 变化中至少每周一次，直到CF - 4的20％是融合。
- 收获细胞中所述B）使用70毫升的胰蛋白酶/ EDTA，约200毫升PBS。
代表性的成果
使用这种隔离方法，我们观察到在12天的主要的集落形成。在先前的研究能够收回平均为4.0 ± 0.8每毫升外周血所得的ECFC 殖民地 4 ECFCs显示一个典型的鹅卵石外观。大规模扩张后，用了100个细胞/平方厘米的播种密度中，我们获得了一个由3男1女志愿者（年龄26至50岁之间）约30天的总> 1 × 10 8个细胞。
在这些条件下培养ECFC增生，功能和基因组稳定4此外细胞可以储存在进一步利用液氮（10％DMSO）3,4
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Discussion
这种新颖的隔离和扩展方法是一种简单而有效的过程，更有效率和更短的时间消耗，避免任何细胞分离（不需要密度梯度），比传统技术更便宜。通过使用pHPL接触到牛抗原和公认的后续xenoimmunization被排除在外。文化期间可形成小血块，pHPL造成。根据我们的经验，这些凝块不影响细胞集落形成和细胞增殖或功能。
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Acknowledgments
作者感谢提供优秀的技术协助pHPL和Margaretha Frühwirth和丹妮拉泰勒博士卡塔琳娜Schallmoser。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
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| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
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| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
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| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
