الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل
Summary
المصل المستخدمة في الثقافات الجنين يحتوي على مكونات غير معروفة يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب وخاصة في الدراسات التي تنطوي على إشارات التفاعلات. نحن هنا لاستخدام الاوكسيجين نظام الثقافة المصل خالية وتبين أن الأجنة منتصف الحمل الماوس تربيتها لمدة 16-40 ساعة تظهر التنمية المورفولوجية مماثلة لأجنة النامية في الرحم.
Abstract
تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس الاستفادة من مستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية في نظام الثقافة زجاجة المتداول الاوكسيجين. أجنة الفئران في E10.5 تم عزل بعناية من الرحم مع سليمة صفار الكيس وفي عملية تنطوي على المناورة جراحية دقيقة الأجنة وexteriorized بلطف من الكيس المحي مع الحفاظ على استمرارية الأوعية الدموية للجنين مع الكيس المحي. مقارنة مع الأجنة أعدت مع سليمة صفار الكيس أو الكيس المحي مع إزالتها، عرضت هذه الأجنة معدل البقاء على قيد الحياة متفوقة والتقدم التنموي عندما مثقف في ظل ظروف مماثلة. وتبين لنا أن هذه الأجنة الماوس، عندما مثقف في المتوسط المحدد في أجواء من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16-40 ساعة، تظهر النمو المورفولوجية والتنمية مماثلة ل الأجنة النامية في الرحم. نعتقد الهو الأسلوب سوف تكون مفيدة للمحققين الذين يحتاجون إلى الاستفادة من ثقافة الجنين كله لدراسة التفاعلات إشارات هامة في توالد الأعضاء الجنينية.
Introduction
في المختبر باستخدام أساليب الثقافة الأجنة كلها هي مناسبة تماما لدراسة الآليات التي تشارك في إشارة توالد الأعضاء الجنينية التي يصعب الوصول إليها إلا في الرحم. توفير الأجنة الجامعة على سلامة الأنسجة والدعم المناسب للتفاعلات الأنسجة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لحدوث الوقت المناسب مما يشير الآليات الأساسية للعمليات الخلوية المختلفة خلال توالد الأعضاء. بينما توفر الثقافات الجنين كله منبرا لمجموعة كبيرة من التطبيقات مثل دراسات الزرع، التلاعب الجيني والأنسجة، والدراسات حبة زرع والدراسات السمية، الخ.، ونظم الثقافة الجنين المستخدمة حاليا تعتمد بشكل أساسي على مصل للنمو السليم والحفاظ على الأجنة في الثقافة 1-9.
وقد استخدمت المصل باعتبارها واحدة من المكونات الرئيسية التي تتراوح 10-100٪ من وسائل الإعلام الثقافة 6-8، 10، 11.؛ ومع ذلك، فإن تركيبة المصل لم يتم تعريف بشكل جيد ويمكن أن تختلف من حيوان إلى حيوان وفي كل مرة يتم جمع المصل. في حين إعداد مختبر المصل هو مضيعة للوقت وينطوي على إجراءات صارمة، مصل شراؤها يسلك تجاريا تفاوتا كبيرا بين الكثير مختلفة ويرفع تكاليف التجريبية. تضاف إلى هذه، قد يحتوي المصل عوامل غير معروفة مثل عوامل النمو والهرمونات والبروتينات أو غيرها، والتي يمكن أن تؤثر على نتائج بعض التجارب، وخاصة تلك التي تنطوي على دراسة إشارات جزيئات مهمة في تفاعلات الأنسجة. وقد أظهرت الدراسات أن إضافة مصل للثقافة يمكن أن يحتمل تغيير مستويات الخلايا من بعض الجزيئات يشير الى مثل أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) والبروتينات المشاركة في إشارة مولد للتفتل وفسفوإينوزيتيد 3 (PI 3) كيناز مسارات إشارات 12-14. خلافا لهؤلاء، نظام الثقافة المصل خالية يوفر مزايا البيئة مستضد الحرة،الامتناع عن الانزيمات النشطة بيولوجيا التي يمكن أن تغير العمليات الخلوية ويتيح الاتساق بين التجارب.
في هذه الدراسة، ونحن تستخدم لمستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية لثقافة مرحلة منتصف الحمل الأجنة كله في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 ° C 15،16. أجنة الفئران مثقف ل16-40 ساعة في ظل هذه الظروف المحددة عرضت التقدم في التنمية الصرفي من الجسم ومختلف الهياكل الشاملة الجنينية مثل القلب والأطراف والمخ والعينين تشير مستويات مناسبة من انتشار الخليوي، والهجرة، والتمايز والتفاعل الأنسجة. وكشف التحليل الجزيئي للالتطور الجنيني في الثقافة لأحد أنظمة جهاز معقد مثل العين تطور العين لتكون متسقة مع تلك التي لوحظت في أنسجة العين في EMBRيوس النامية في الرحم (Kalaskar وودرديل، قيد الإعداد). وهكذا تبين لنا أن أجنة الفئران مثقف في مرحلة منتصف الحمل، تظهر النمو المطرد والتنمية المورفولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في الأجنة النامية في الرحم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية. كان تطور الجنين داخل الرحم السابقين اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة أثناء الإجراء من وقت عزل ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور جولي غوردون والدكتورة نانسي مانلي للحصول على المشورة المفيدة مع تقنية الثقافة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الزرق الأطفال وشارون ستيوارت انعدام القزحية تراست البحوث.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
