Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development
Summary
Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.
Abstract
Orta gebelik aşama fare embriyoları oksijenli haddeleme şişe kültür sistemi içinde ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak kültürlenmiştir. E10.5 fare embriyoları dikkatlice sağlam yumurta sarısının ile rahim izole edildi ve yolk kesesi ile embriyonun damar sürekliliğini korurken hassas cerrahi manevra kapsayan bir süreçte embriyoların yavaşça sarısı kesesi eksterioze edildi. Bozulmamış yolk kesesi veya uzaklaştırılarak yumurta sarısı ile hazırlanan embriyolar ile karşılaştırıldığında, bu embriyolar, üstün hayatta kalma oranı ve benzer koşullar altında kültüre gelişim ilerlemesi sergiledi. Biz, bu fare embriyoları, ne 16-40 saat boyunca 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde tanımlanmış bir ortam içinde kültürlendi, karşılaştırılabilir morfolojik büyüme ve gelişme sergilerler olduğunu göstermektedir Embriyoların rahimde gelişmekte. Biz inci inanıyorumyöntem embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri incelemek için, tüm embriyo kültürünü kullanmak için ihtiyaç duyan araştırmacılar için yararlı olacaktır.
Introduction
In vitro bütün embriyolarını kullanarak kültür yöntemleri utero erişimi aksi takdirde zor olan embriyonik organogeneziste alan mekanizmaların sinyalizasyon incelemek için uygundur. Tüm embriyolar doku bütünlüğünü sağlamak ve gerekli mekanizmaları sinyalizasyon zamanında oluşumu için önemli olan doku etkileşimleri için uygun destek organojenez esnasında farklı hücresel süreçler için. Bütün embriyo kültürleri vb nakli çalışmaları, genetik ve doku manipülasyonları, boncuk implantasyon çalışmaları, toksikolojik çalışmalar, gibi uygulamalar bir bolluk için bir platform sağlarken., Şu anda kullanılan embriyo kültür sistemleri embriyoların uygun büyüme ve bakım için serum esas bağımlı kültür 1-9.
Serum kültür ortamı 6-8, 10, 11% 10-100 arasında değişen en önemli bileşenlerinden biri olarak kullanılmıştır., Bununla birlikte, serumun bileşim, iyi tanımlanmış değildir ve hayvandan hayvana farklı olabilir ve her zaman serum toplanır. Serum laboratuvar hazırlık zaman alıcı ve sıkı prosedürleri içerir iken, tedarik serum ticari farklı partiler arasında önemli değişkenlik gösterir ve deneysel maliyetlerini yükseltir. Bunlara ek olarak, serum gibi potansiyel olarak bazı deneylerin sonuçlarını etkileyebilir büyüme faktörleri, hormonlar veya başka proteinler, doku etkileşimlerinin önemli sinyal molekülleri çalışma gerektirir özellikle bu bilinmeyen faktörler içerebilir. Çalışmalar kültüre serumu ilaveli potansiyel olarak siklik adenosin monofosfatın (cAMP) ve mitojenik sinyal ve fosfoinositid 3 katılan proteinleri (3 PI) kinaz geçitler 12-14 sinyal gibi bazı sinyal moleküllerinin hücre içi seviyelerini değiştirebilir göstermiştir. Bu aksine, bir serum içermeyen kültür sistemi, antijen serbest ortamının avantajlar sağlamaktadırhücresel süreçleri değiştirebilir ve biyolojik olarak aktif enzimleri oruç deneyleri arasında tutarlılık sağlar.
Bu çalışmada, 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde kültür orta gebelik aşama bütün embriyolar için ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılmaktadır C 15,16 °. Bu tanımlanan koşullar altında 16-40 saat için kültürlenmiştir Fare embriyolar hücresel çoğalma, göç ve farklılaşma doku etkileşimlerinin uygun seviyelerini gösteren bu kalp, kol, beyin ve göz gibi genel embriyonik gövde ve farklı yapılarda morfolojik gelişiminde ilerlemesi sergiledi. Göz gibi karmaşık organ sistemlerinin biri için kültüründe embriyonik gelişme moleküler analizi embr okular doku gözlemlenen ile tutarlı olması için, oküler gelişimini sergilemiştirYÖS (hazırlık, Kalaskar ve Lauderdale) rahimde gelişmekte. Böylece orta gebelik aşamasında kültürlendi fare embriyoları, rahimde embriyo geliştirme gözlenen ile karşılaştırılabilir aşamalı büyüme ve gelişme sergilerler morfolojik göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orta gebelik aşama fare embriyoları, 37 ° C'de% 95 O 2/5 bir haddeleme şişe kültür cihazı içinde% CO2 atmosferinde bir serum içermeyen kültür ortamı içinde kültürlendi Embriyo gelişme ex utero rahim kültürün tamamlanmasından (Şekil 1) için ötenazi farelerden izole edilir zaman, işlem sırasında her adımında birden fazla faktöre bağımlı idi. Gelişimini etkileyen en önemli faktör kültürü başlatmak için alınan zaman oldu. En çok d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kültür tekniği ile onların yararlı tavsiye için Dr Julie Gordon ve Dr Nancy Manley teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Çocuk Glokom Vakfı ve Sharon-Stewart Aniridi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
