Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero
Summary
El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.
Abstract
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.
Introduction
In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaciones genéticas y de tejidos, estudios de implantación del grano, los estudios toxicológicos, etc., Los sistemas de cultivo de embriones utilizados actualmente son principalmente dependientes de suero para el crecimiento y mantenimiento de los embriones en la cultura de 1-9.
El suero se ha utilizado como uno de los principales componentes que van desde 10-100% de los medios de cultivo 6-8, 10, 11.; Sin embargo, la composición de suero no está bien definida y puede variar de animal a animal y cada vez que se recogió el suero. Si bien la preparación de laboratorio de suero es mucho tiempo e implica procedimientos estrictos, suero adquirido comercialmente exhibe una gran variabilidad entre los distintos lotes y aumenta los costes de experimentación. Sumado a esto, el suero puede contener factores desconocidos, tales como factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, que pueden afectar potencialmente el resultado de ciertos experimentos, especialmente aquellos que involucran el estudio de las moléculas de señalización importantes en las interacciones de tejidos. Los estudios han demostrado que la adición de suero a la cultura puede potencialmente alterar los niveles intracelulares de ciertas moléculas de señalización tales como monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y de las proteínas implicadas en la señalización mitogénica y la fosfoinositida 3 (PI-3)-quinasa vías de señalización 12-14. Contrariamente a esto, un sistema de cultivo libre de suero proporciona las ventajas de ambiente libre de antígenos,abstinencia de enzimas biológicamente activas que pueden alterar los procesos celulares y permite la coherencia entre experimentos.
En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado a la cultura de la etapa de mediados de la gestación de embriones enteros en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C 15,16. Los embriones de ratón cultivados durante 16 a 40 h bajo estas condiciones definidas exhiben la progresión en el desarrollo morfológico de cuerpo y diferentes estructuras embrionarias generales tales como el corazón, las extremidades, el cerebro y los ojos que indica los niveles apropiados de la proliferación celular, la migración, la diferenciación y las interacciones de tejido. El análisis molecular del desarrollo embrionario en el cultivo para uno de los sistemas de órganos complejos como el ojo reveló el desarrollo ocular para ser consistente con la observada en el tejido ocular en EMBRyos en desarrollo en el útero (Kalaskar y Lauderdale, en preparación). Por lo tanto nos muestran que los embriones de ratón en cultivo en la etapa mitad de la gestación, exhiben crecimiento progresivo y el desarrollo morfológico comparable a la observada en los embriones en desarrollo en el útero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Julie Gordon y el Dr. Nancy Manley por sus consejos útiles con la técnica de cultivo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación del Niño Glaucoma y Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
