Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d'embryons sans sérum

Summary

Sérum utilisé dans les cultures d'embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d'expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Abstract

L'embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées en utilisant un milieu de culture sans sérum disponibles dans le commerce préparé à partir de suppléments de milieux de cellules souches dans un système de culture de flacon roulant oxygéné. Des embryons de souris à E10.5 ont été soigneusement isolés à partir de l'utérus intact avec le sac vitellin et dans un processus impliquant geste chirurgical précis les embryons ont été extériorisés doucement à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant la continuité vasculaire de l'embryon avec le sac vitellin. Par rapport aux embryons préparés avec intact sac vitellin ou avec le sac vitellin éliminée, ces embryons exposés taux de survie supérieur et la progression du développement quand elle est cultivée dans des conditions similaires. Nous montrons que ces embryons de souris, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu défini dans une atmosphère de 95% O _2/5% CO ₂ dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C pendant 16 à 40 heures, présentent une croissance et un développement comparable à morphologique les embryons en développement in utero. Nous croyons èmeest la méthode sera utile pour les enquêteurs qui ont besoin d'utiliser la culture de l'embryon entier pour étudier les interactions importantes dans l'organogenèse embryonnaire de signalisation.

Introduction

Méthodes in vitro de culture en utilisant des embryons entiers sont bien adaptés à l'étude des mécanismes impliqués dans l'organogenèse embryonnaire qui sont difficiles d'accès dans l'utérus de signalisation. Embryons entiers fournissent l'intégrité des tissus et de soutien appropriés pour les interactions de tissus qui sont cruciaux pour survenue en temps opportun des mécanismes essentiels de signalisation pour les différents processus cellulaires pendant l'organogenèse. Tandis que les cultures d'embryons entiers fournissent une plate-forme pour une multitude d'applications telles que des études de transplantation, les manipulations génétiques et de tissus, des études perle d'implantation, études toxicologiques, etc., Des systèmes de culture d'embryons actuellement utilisés dépendent principalement de sérum pour la croissance et l'entretien des embryons dans la culture ^{de 1 à 9.}

Le sérum a été utilisé comme l'un des principaux composants allant de 10 à 100% du milieu de culture ^{8.6, 10, 11.}; Cependant, la composition de sérum n'est pas bien défini et peut varier d'un animal à chaque fois, et le sérum est recueilli. Alors que la préparation de sérum de laboratoire est consommatrice de temps et implique des procédures strictes, sérum procuré présente commercialement variabilité considérable entre les différents lots et augmente les coûts de laboratoire. Ajoutés à ceux-ci, le sérum peut contenir des facteurs inconnus tels que des facteurs de croissance, des hormones, ou d'autres protéines, qui peuvent avoir une incidence sur les résultats de certaines expériences, en particulier ceux qui impliquent l'étude des molécules importantes dans les interactions tissulaires de signalisation. Des études ont montré que l'addition de sérum à la culture peut potentiellement modifier les niveaux intracellulaires de certaines molécules de signalisation telles que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et les protéines impliquées dans la signalisation mitogénique et 3 phosphoinositide (PI 3)-kinase voies de signalisation ^12-14. Contrairement à ceux-ci, un système de culture sans sérum offre les avantages de l'antigène libre environnement,abstinence de enzymes biologiquement actives qui peuvent altérer les processus cellulaires et permet la cohérence entre les expériences.

Dans la présente étude, nous avons utilisé un milieu de culture sans sérum préparé à partir de commerce suppléments de milieux de cellules souches à toute la culture étape à mi-gestation des embryons dans une atmosphère de 95% d'O _2/5% de CO ₂ dans un appareil de culture de la bouteille de roulement à 37 ° C ^15,16. Des embryons de souris en culture pendant 16 à 40 heures dans ces conditions définies présentaient progression dans le développement morphologique des structures du corps et les différentes embryonnaires globaux tels que le cœur, les membres, le cerveau et les yeux indiquant des niveaux appropriés de la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation et interactions tissulaires. L'analyse moléculaire du développement embryonnaire dans la culture de l'un des systèmes organiques complexes tels que l'œil a révélé la mise au point oculaire d'être cohérent avec celui observé dans le tissu oculaire dans embryo développement in utero (Kalaskar et Lauderdale, en préparation). Ainsi, nous montrons que les embryons de souris en culture au stade mi-gestation, affichent une croissance progressive et le développement morphologique comparable à celle observée dans les embryons en développement in utero.

Protocol

Embryon de souris culture: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en stricte conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices en suivant le protocole # A2010 07-119, qui a été examiné et approuvé par l'Université de Géorgie institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité, qui assure la surveillance réglementaire continue. Une. Préparation de milieux de culture Préparer le mi…

Representative Results

Le développement d'embryons de souris ex utero dépend de multiples facteurs de départ à partir du moment de l'utérus est isolé de l'organisme à la fois les embryons sont mis en culture. Comme représenté sur la figure 1, la procédure implique une série d'étapes comprenant la séparation de l'utérus gravide à partir du corps (figure 1A), l'isolement des embryons avec sac vitellin intact (figure 1B), l'extériorisation des…

Discussion

L'embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% O _2/5% CO ₂ dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C. le développement de l'embryon ex utero dépendait essentiellement de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment de l'utérus est isolé à partir des souris euthanasiées à la fin de la culture (Figure 1). Le facteur…

Materials

KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic – Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified – Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified – Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified – Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette – 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S