Мышь эмбрионального развития целая культура системе эмбрионов бессывороточных
Summary
Сыворотка используется в эмбриональных культур содержит неизвестные компоненты, которые могут повлиять на исход экспериментов, особенно в исследованиях с участием сигнальных взаимодействий. Здесь мы использовали кислородом систему культуры бессывороточную и показать, что эмбрионы середине беременности мыши, культивированные в течение 16-40 часов проявляют морфологическое развитие, сравнимую с эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.
Abstract
Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали с использованием бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ в качестве кислородом системе культуры прокатки бутылки. Мышиные эмбрионы в E10.5 были тщательно изолированы от матки с неповрежденной желточного мешка и в процессе с участием точное хирургическое маневр эмбрионы были аккуратно выводили из желточного мешка при сохранении сосудистую непрерывность эмбриона с желточного мешка. По сравнению с эмбрионами, приготовленных с неповрежденной желточного мешка или с желточного мешка удаляется, эти эмбрионы выставлены превосходную выживаемость и прогрессирование с развитием при культивировании в аналогичных условиях. Покажем, что эти мышиные эмбрионы, при культивировании в определенной среде, в атмосфере 95% O 2/5% CO 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С в течение 16-40 ч, проявляют морфологическое рост и развитие сопоставимы с эмбрионы развиваются в период внутриутробного развития. Мы считаем йявляется метод будет полезен для исследователей, нуждающихся использовать всю культуру эмбрионов для изучения сигнальных взаимодействий важные в эмбриональном органогенеза.
Introduction
В пробирке способы культивирования, использующие целые эмбрионы хорошо подходят для изучения механизмов, участвующих в эмбриональном органогенеза которые в противном случае трудно получить доступ в утробе сигнализации. Целые эмбрионы обеспечивают целостность тканей и поддерживает подходит для тканевых взаимодействий, которые имеют решающее значение для своевременного появления механизмов существенные сигнализации для различных клеточных процессов во время органогенеза. В то время как целые культуры эмбрионов обеспечить платформу для множества приложений, таких как трансплантации исследований, генетических и тканей манипуляций, шарик имплантации исследований, токсикологических исследований, и т.д.., Используемые в настоящее время системы культуры эмбрионов в основном зависят от сыворотки для правильного роста и поддержания эмбрионов в культуре 1-9.
Сыворотка была использована в качестве одного из основных компонентов в пределах от 10-100% от культуральной среды 6-8, 10, 11.; Однако состав сыворотки не определена и может отличаться от животного к животному, и каждый раз собирают сыворотку. В то время как подготовка лаборатория сыворотке занимает много времени и включает в себя строгие процедуры, сыворотка закуплены коммерчески демонстрирует значительные различия между различными партиями и повышает экспериментальные расходы. К этому следует добавить, сыворотка может содержать неизвестные факторы, такие как факторы роста, гормоны, или других белков, которые потенциально могут повлиять на исход некоторых экспериментах, особенно те, которые связаны с изучением сигнальных молекул важные в тканевых взаимодействий. Исследования показали, что добавление сыворотки в культуре может потенциально изменить внутриклеточные уровни определенных сигнальных молекул, таких как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и белков, участвующих в митогенной сигнализации и фосфоинозитид 3 (PI 3)-киназы сигнальных путей 12-14. В отличие от них, система культуры бессывороточной обеспечивает преимущества антигена среде, свободной,воздержание от биологически активных ферментов, которые могут изменить клеточные процессы и позволяет согласованности экспериментов.
В настоящем исследовании мы использовали бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ, чтобы культура стадии середине беременности целых эмбрионов в атмосфере 95% O 2/5% CO 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С 15,16. Эмбрионы мыши, культивированные в течение от 16 до 40 ч в этих определенных условиях выставлены прогрессирование в морфологического развития общих эмбриональных тела и различных структур, таких как сердце, конечностей, мозга и глаз, указывающий соответствующие уровни клеточной пролиферации, миграции, дифференциации и тканевых взаимодействий. Молекулярный анализ эмбрионального развития в культуре для одного из сложных систем органов, таких как глаза раскрыл глазной развития в соответствие с наблюдаемым в глазной ткани в EMBRйо развивается в утробе матери (Kalaskar и Лодердейл, в процессе подготовки). Таким образом, мы показали, что мышиные эмбрионы культивировали на стадии середине беременности, обладают поступательный рост и морфологическое развитие, сравнимую с наблюдается у эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O 2/5% СО 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С Развитие эмбриона экс маточно в решающей степени зависит от множества факторов на каждом шаге во время пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джули Гордон и доктор Нэнси Мэнли за их полезные советы с техникой культуры. Эта работа была поддержана Детским глаукомы фонда и Шарон-Стюарт Аниридия Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
