עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר
Summary
סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.
Abstract
עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית ניצול מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי במערכת תרבות בקבוק מתגלגל מחומצן. עוברי עכברים בE10.5 בודדו בקפידה מתוך הרחם עם שק חלמון בשלמות ובתהליך כרוך תמרון כירורגית מדויק עוברי exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על ההמשכיות וכלי הדם של העובר עם שק החלמון. בהשוואה לעוברים מוכנים עם שק חלמון ללא פגע או עם שק החלמון הוסר, עובר אלה הוצגו שיעור הישרדות מעולה והתקדמות התפתחותית כאשר בתרבית בתנאים דומים. אנו מראים כי עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית במדיום מוגדר באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה 16-40, מפגינים צמיחה והתפתחות מורפולוגית להשוות העוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים ההשיטה תהיה שימושית עבור חוקרי צורך לנצל תרבות עובר שלמה כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי.
Introduction
במבחנה שיטות תרבות ניצול כל העוברים מתאימות גם ללמוד איתות מנגנונים המעורבים בorganogenesis העוברי שקשים אחרת לגישה ברחם. עוברים שלמים לספק את שלמות הרקמות ותמיכה מתאימה לאינטראקציות רקמות, כי הם חיוניים להתרחשות בזמן של איתות מנגנונים חיוניים לתהליכים תאיים שונים במהלך organogenesis. בעוד תרבויות עובר כולו לתת במה לשפע של יישומים, כגון לימודי השתלה, מניפולציות גנטיות ורקמות, מחקרי השתלת חרוז, מחקרי טוקסיקולוגי, וכו '., מערכות תרבות עובר מנוצלים כיום הן בעיקר תלויות בסרום לצמיחה ולתחזוקה נאותות של העוברים בתרבות 1-9.
הסרום נוצל כאחד המרכיבים העיקריים הנעים 10-100% מהתקשורת והתרבות 6-8, 10, 11.; עם זאת, ההרכב של סרום אינו מוגדר היטב והוא יכול להיות שונה מבעלי החיים לבעלי חיים ובכל פעם הסרום נאסף. בזמן הכנת מעבדה של סרום היא זמן רב וכרוכה בנהלים מחמירים, סרום רכש מסחרי מציג שונות רבות בקרב הרבה שונים ומעלה את עלויות ניסוי. נוסף על אלה, בסרום עשוי להכיל גורמים בלתי ידועים כגון גורמי גדילה, הורמונים, או חלבונים אחרים, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ניסויים מסוימים, בעיקר אלה הכרוכות במחקר של מולקולות איתות חשובות באינטראקציות רקמות. מחקרים הראו כי תוספת של סרום לתרבות עלולה לשנות את הרמות תאית של מולקולות איתות מסוימות, כגון monophosphate המחזורי אדנוזין (cAMP) וחלבונים מעורבים איתות וphosphoinositide 3 mitogenic (PI 3)-kinase איתות מסלולים 12-14. בניגוד לאלה, מערכת תרבות סרום ללא מספקת את היתרונות של סביבת אנטיגן חופשי,התנזרות מאנזימים פעילים ביולוגי, שיכול לשנות את התהליכים התאיים ומאפשרת עקביות בין ניסויים.
במחקר הנוכחי, אנו מנוצלים מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי לעוברי כל שלב אמצע הריון התרבות באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C 15,16. עוברי עכבר בתרבית למשך 16-40 שעות בתנאים המוגדרים אלה הציגו התקדמות בפיתוח צורני של גוף ושונה מבנים עובריים הכלליים כגון לב, גפיים, מוח ועיניים המצביעים על הרמות המתאימות של התרבות תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות רקמות. ניתוח מולקולרי של ההתפתחות העוברית בתרבות לאחת ממערכות האיברים מורכבות כמו העין חשף את הפיתוח העיני להיות עקבי עם זה שנצפה ברקמת העין בembryos מתפתח ברחם (Kalaskar ולודרדייל, בהכנה). כך אנו מראים כי עוברי עכבר בתרבית בשלב אמצע הריון, מפגינים צמיחה מתקדמת ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם.
Protocol
Representative Results
Discussion
עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית בתקשורת ותרבות בסרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. הרחם לשעבר התפתחות עובר היה תלוי באופן קריטי במספר גורמים: בכל שלב במהלך ההליך מרגע שהרחם בודד מהעכברים מורדמים ועד לסיומה של התר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר ג'ולי גורדון וד"ר ננסי מנלי לעצות מועילות שלהם עם טכניקת התרבות. עבודה זו נתמכה על ידי הגלאוקומה הקרן לילדים ושרון-סטיוארט Aniridia אמון מחקר.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
