Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System
Summary
Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.
Abstract
Mitte der Schwangerschaft Bühne Maus-Embryonen kultiviert wurden unter Verwendung eines Serum-freien Kulturmedium aus kommerziell verfügbaren Stammzell Medien Ergänzungen in einer sauerstoffhaltigen Rollflaschenkultur System vorbereitet. Maus-Embryonen E10.5 wurden sorgfältig von der Gebärmutter mit intakten Dottersack isoliert und in einem Prozess, der eine präzise chirurgische Manöver wurden die Embryonen vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt, während die Gefäß Kontinuität der Embryo mit Dottersack. Im Vergleich zu Embryonen mit intakter Dottersack oder mit dem Dottersack entfernt vorbereitet, zeigten diese Embryonen überlegene Überlebensrate und Entwicklungsfortschritt unter ähnlichen Bedingungen, wenn kultiviert. Wir zeigen, daß diese Maus-Embryonen, wenn in einem definierten Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C für 16-40 h kultiviert, morphologische Entwicklung und Wachstum vergleichbar die Embryonen in der Gebärmutter entwickeln. Wir glauben, thVerfahren ist nützlich für die Ermittler brauchen, um ganze Embryokultur nutzen, um Signal Wechselwirkungen in der embryonalen Organentwicklung wichtig zu studieren.
Introduction
In-vitro-Kultur Verfahren, die ganze Embryonen sind gut geeignet, um zu studieren Signalmechanismen in der embryonalen Organentwicklung beteiligt, die sonst nur schwer zugänglich sind, in utero. Ganze Embryonen bieten die Gewebeintegrität und Unterstützung für die Gewebe-Wechselwirkungen, die von entscheidender Bedeutung für die rechtzeitige Auftreten von Signalmechanismen unerlässlich sind angemessen für verschiedene zelluläre Prozesse während der Organogenese. Während ganze Embryokulturen bieten eine Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen, wie Transplantationsstudien, genetische Manipulationen und Gewebe-, Perl-Implantationsstudien, toxikologische Studien, etc. Sind derzeit genutzt Embryokultur-Systeme vor allem abhängig von Serum für die ordnungsgemäße Wachstum und die Erhaltung der Embryonen in der Kultur 1-9.
Serum wurde als einer der Hauptbestandteile im Bereich von 10-100% der Kulturmedien 6-8, 10, 11 genutzt., Aber die Zusammensetzung von Serum ist nicht gut definiert und können von Tier zu Tier verschieden, und jedes Mal das Serum gesammelt. Während Laborherstellung von Serum ist zeitaufwendig und erfordert strengen Verfahren, Serum beschafft im Handel weist erhebliche Variabilität zwischen verschiedenen Lose und wirft Versuchskosten. Hinzu kann das Serum unbekannte Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Hormonen oder anderen Proteinen, die potenziell beeinflussen kann das Ergebnis bestimmter Versuche, insbesondere jene, die die Untersuchung von Signalmolekülen in Gewebe Wechselwirkungen wichtig einschliessen. Studien haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum zu Kultur kann möglicherweise die intrazellulären Niveaus von bestimmten Signalmoleküle, wie z. B. zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und Proteine in mitogene Signalgebung und Phosphoinositid-3 beteiligt (PI-3)-Kinase-Signalwege 12-14 zu verändern. Im Gegensatz zu dieser liefert ein serumfreies Kultursystem die Vorteile der Antigen freien Umgebung,Abstinenz von biologisch aktiven Enzyme, die die Zellprozesse verändern und ermöglicht Konsistenz zwischen Experimenten.
In der vorliegenden Untersuchung verwendeten wir ein serumfreies Kulturmedium aus kommerziell erhältlichen Stammzellkulturmedien Ergänzungen der Mitte der Schwangerschaft Stufe ganzen Embryos in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung hergestellt bei 37 ° C 15,16. Maus-Embryonen, die für 16 bis 40 Stunden unter diesen definierten Bedingungen kultiviert ausgestellt Progression in morphologische Entwicklung der gesamten embryonalen Körper und verschiedenen Strukturen wie Herz, Gliedmaßen, Gehirn und Augen anzeigt geeigneten Ebenen der zellulären Proliferation, Migration, Differenzierung und Gewebe-Wechselwirkungen. Die molekulare Analyse der embryonalen Entwicklung in der Kultur für eine der komplexen Organsystemen wie dem Auge zeigte die Augenentwicklung mit dem in dem Augengewebe in embr beobachtet, dassJos Entwicklung in utero (Kalaskar und Lauderdale, in Vorbereitung). So zeigen wir, dass Mäuseembryonen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne kultiviert, zeigen progressive Wachstum und morphologische Entwicklung vergleichbar mit der in der Entwicklung Embryonen in utero beobachtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitte der Schwangerschaft Stufe Maus-Embryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C kultiviert Entwicklung des Embryos ex utero war bei jedem Schritt kritisch abhängig von mehreren Faktoren während des Verfahrens ab dem Zeitpunkt der Uterus der Maus euthanasiert zur Vervollständigung der Kultur (1) isoliert. Der wichtigste Faktor, der die Entwicklung beeinflusst war die Zei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Julie Gordon und Dr. Nancy Manley für ihre hilfreiche Ratschläge mit der Kulturtechnik zu danken. Diese Arbeit wurde von der Kinder-Glaukom-Stiftung und Sharon-Stewart Aniridie Research Trust unterstützt.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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