무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발
Summary
배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.
Abstract
중간 회임 스테이지 마우스 배아 산소화 롤링 병 배양 시스템에서 시판 줄기 세포 미디어 보조제로부터 제조 무 혈청 배지를 이용하여 배양 하였다. E10.5에서 마우스 배아는 신중 그대로 난황과 자궁에서 분리하고, 난황과 태아의 혈관 연속성을 유지하면서 정확한 수술 기동을 포함하는 과정에서 배아는 부드럽게 난황에서 exteriorized했다. 그대로 난황 또는 제거 난황을 준비 배아에 비해,이 배아는 우수한 생존율과 유사한 조건에서 배양 개발 진행을 보였다. 우리는이 마우스 배아 때 16-40 시간 동안 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 정의 된 배지에서 배양, 비교 형태의 성장과 발전을 전시 것을 보여 배아는 자궁에 개발. 우리는 토륨 생각방법은 배아의 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아 문화를 활용할 필요가 조사에 유용 할 것입니다.
Introduction
체외에서 전체 배아를 이용한 배양 방법은 자궁에 접근하기 어려운 배아의 기관 형성에 관여 메커니즘을 신호 공부하기에 적합합니다. 전체 배아 조직의 무결성을 제공하고 필수적인 메커니즘을 신호의 적시 발생에 매우 중요한 조직의 상호 작용에 대한 적절한 지원 기관 형성 기간 동안 다른 세포 과정에 대한. 전체 배아 문화는 등 이식 연구, 유전자 및 조직 조작 구슬 주입 연구, 독성 연구, 같은 응용 프로그램의 과다를위한 플랫폼을 제공하는 반면., 현재 사용 배아 배양 시스템은 태아의 적절한 성장과 유지 보수를위한 혈청에 주로 의존 문화 1-9.
혈청 배양 배지 6 ~ 8, 10, 11의 10-100%에 이르기까지의 주요 구성 요소의 하나로서 활용되고 있습니다.하지만, 혈청의 조성물은 잘 정의되지 않은 동물 및 동물에 따라 다를 수 있고, 각 시간은 혈청을 수집한다. 혈청 실험 준비 시간을 소모하고 엄격한 절차를 포함하는 동안, 조달 혈청 상업적으로 다른 많은 사이에 상당한 변화를 전시 및 실험 비용을 발생시킵니다. 이러한 추가, 혈청은 잠재적으로 특정 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 단백질, 조직의 상호 작용에 중요한 신호 분자의 연구를 포함하는 특히 알 수없는 요소를 포함 할 수있다. 연구는 문화 혈청의 첨가가 잠재적으로 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 및 세포 분열 신호 및 phosphoinositide 3에 관련된 단백질 (PI 3) – 키나제 경로 12-14 신호와 같은 특정 신호 전달 분자의 세포 내 수준을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들과는 반대로, 무 혈청 배양 시스템은 항원이없는 환경의 이점을 제공한다세포 프로세스를 변경할 수 생물학적 활성 효소 절제 실험 사이의 일관성을 가능하게합니다.
본 연구에서는 37에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에서 문화 중반 태동 단계 전체 배아에 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 미디어 보충제 제조 된 무 혈청 배지를 이용 C 15, 16 °. 이러한 정의 된 조건에서 16-40 시간 동안 배양 한 쥐의 배아 세포의 증식, 이동, 분화 및 조직 상호 작용의 적절한 수준을 나타내는 등의 심장, 사지, 뇌, 눈 등 전체 배아 몸과 다른 구조의 형태 개발 진행을 보였다. 같은 눈과 같은 복잡한 장기 시스템 중 하나에 대한 문화의 배아 발달의 분자 분석은 EMBR에 안구 조직의 관찰과 일치하는 눈 개발을 발표YOS는 (준비, Kalaskar과 로더데일) 자궁에서 개발. 따라서 우리는 중앙 임신 단계에서 배양 한 쥐의 배아가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 진보적 인 성장과 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중간 임신 단계 마우스 배아는 37 ° C에서 95 % O 2 / 5 더 롤링 병 배양 장치에서 %의 CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배양 하였다 배아 개발 EX의 자궁은 자궁이 문화의 완성 (그림 1)에 안락사 생쥐에서 분리되는 순간부터 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존했다. 발전을 좌우하는 가장 중요한 요소는 배양을 시작하는 데 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 문화 기술과의 도움이 조언을 쥴리 고든 박사 낸시 맨리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 어린이 녹내장 재단과 샤론 – 스튜어트 무 홍채 증 연구들에 의해지지를 받고 있습니다.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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