إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
وتستخدم مجموعة متنوعة من الحيوانات النموذج في البيولوجيا التطورية للتحقيق في الآليات التنموية على المستويين الجزيئي والخلوي. على سبيل المثال، استخدمت على نطاق واسع نوعا من البرمائيات والطيور كحيوانات النموذج الكلاسيكي التي هي مناسبة للتلاعب مباشرة من الأجنة لأن هذه الأجنة تطوير خارج الأم. وعلى النقيض من هذه الحيوانات، أجنة الثدييات ينمو في رحم الأم، والنمو في مراحل لاحقة تعتمد بشكل حاسم على وظيفة الرحم. وبالتالي، فمن الصعب عادة لمعالجة الأجنة مباشرة الثدييات مثل تلك التي من الماوس والفئران في مراحل مبكرة. في 1960s، التي أنشئت دينيس جديد الثدييات ثقافة الجنين كله (WEC) باستخدام تقنية الأجهزة WEC مع امدادات الاوكسجين المستمر ومراقبة الحرارة 1. في WEC، يمكن أن الماوس والفئران الأجنة تنمو خارج الجسم، (أي خارج الرحم). على الرغم من أن تقنية WEC كثيرا ما كان يستخدم في المسخ عن طريق إضافة مختلف كيميائيآل مركبات في مستنبت، كما تم استخدام هذه التقنية في مختلف الدراسات البيولوجيا التطورية لدراسة الآليات التنموية الفريدة في الثدييات 2-4. على سبيل المثال، يتم الجمع بين WEC مع تقنيات أخرى، مثل وضع العلامات الخلية، في البرية من نوع ومتحولة الأجنة باستخدام صبغة الفلورسنت 5، 6 زرع الخلايا، وإدخال الجين عبر lipofection 7 و electroporation 8-13.
في الآونة الأخيرة، في التلاعب الرحم وقد استخدمت لتحليل العمليات التنموية في الأجنة القوارض في مراحل لاحقة، وقد تم دمجها مع تقنيات التثقيب الكهربائي 14-16. ولكن هذه التقنيات ليست مناسبة للتلاعب من الأجنة postimplantation وmidgestation بسبب صعوبات تحقيق الحقن المحلية دقيقة من الحل الحمض النووي في الأجنة في المراحل المبكرة. على الرغم من أن زرع الخلايا الموجهة بالأمواج فوق الصوتية وحقن النواقل الفيروسية في الأجنة في وقت مبكر (أي، تم الإبلاغ عن E8.5-E-9.5 في الماوس) في الرحم سابقا 17،18، يطلب من مهارات ممتازة لتنفيذ هذه التجارب مع نسبة نجاح عالية. وبالتالي، مع إمكانية الوصول WEC عالية فيفو السابقين مزاياه فيما يتعلق التلاعب الماوس والفئران الأجنة.
وكثيرا ما يستخدم طرد فورا (IC) مصل الفئران المحضرة من الفئران الذكور لمتوسطة WEC. عند الأجنة هي مثقف في مرحلة postimplantation (أي، في وقت سابق من E8.0 في الماوس أو E10.0 في الفئران)، وغالبا ما يتم استخدام خليط من المتوسطة الاصطناعية وIC مصل الفئران كوسيلة للWEC 19. ولكن، لأجنة الثقافة في منتصف الحمل (أي.، E8.0-12.5 في أجنة الفئران أو E10.0-E14.5 في الأجنة الفئران)، ينبغي استخدام 100٪ مصل كوسيلة لأنه لا يوجد وسائل الإعلام البديلة المتاحة حاليا تسمح أجنة تنمو عادة في المختبر لأكثر من 2 أيام.
إعداد عالية الجودة مصل الفئرانخطوة حاسمة لتحقيق استنساخ التجارب في WEC. مقارنة تأخر الطرد المركزي، IC له فائدة في الحد من انحلال الدم عندما يتم جمع الدم عن طريق الضغط على تجلط الليفين لأن معظم خلايا الدم الحمراء وقد تم بالفعل فصل من جلطة الفيبرين. كما فشل مصل الفئران الانحلالي لدعم النمو الطبيعي للأجنة الجرذان والفئران، وإعداد المصل باستخدام الطرد المركزي المباشر هو الأفضل لإعداد باستخدام تأخر الطرد المركزي. بروتوكول لدينا يحتوي على اثنين من خطوات إضافية مقارنة مع غيرها من البروتوكولات 18-20 (مثال. وتخزين الدم التي تم جمعها على الجليد قبل الطرد المركزي الأول والحفاظ على عينات الدم التي تم جمعها لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية بعد الطرد المركزي الأول). الخطوة السابقة يمكن تأخير تشكيل تجلط الدم، والخطوة الأخيرة تعزز التصلب من جلطة الليفين لسهولة الضغط. لذلك، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها من قبل المبتدئين. ومع ذلك، استنساخ جمع الدم والمصلاستخراج بدقة بمجرد اشارة الى الكتب البروتوكول هو في غاية الصعوبة 19-21. في هذه المقالة الفيديو، علينا أن نظهر بروتوكول لدينا معيار لإعداد الأمثل مصل الفئران IC، والذي يتضمن جمع الدم من الشريان الأورطي البطني من الفئران الذكور واستخراج المصل بواسطة الطرد المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
النتائج استنساخه في التجارب WEC تعتمد على استخدام ذات جودة عالية IC مصل الفئران ودقيقة تقنية الجنين تشريح 3. لا تقصير فترة الصيام قبل جمع الدم بسبب الصيام هو ضروري لتوحيد تركيزات الجلوكوز في الدم. لا ينبغي أن تستخدم إناث الفئران من أجل إعداد المصل لأن مستويات هرمو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
