Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Summary

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Abstract

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Introduction

Uma variedade de modelos animais são utilizados na biologia do desenvolvimento para investigar os mecanismos de desenvolvimento aos níveis celular e molecular. Por exemplo, as espécies de anfíbios e de aves foram amplamente utilizados como animais modelo clássicas que são adequados para a manipulação directa de embriões porque estes embriões se desenvolvem fora da mãe. Em contraste a estes animais, embriões de mamíferos crescem no útero da mãe, e em fases posteriores do crescimento é crucialmente dependente da função do útero. Portanto, é normalmente difícil de manipular diretamente embriões de mamíferos, como os do rato e rato em estágios iniciais. Na década de 1960, Denis New estabeleceu um conjunto de mamíferos cultura de embriões (WEC) técnica usando aparatos WEC com um suprimento contínuo de oxigênio e controle de calor ^1. Em WEC, ratinhos e ratos de embriões podem crescer ex vivo (isto é, fora do útero). Embora a técnica WEC foi muitas vezes utilizado em teratologia, adicionando vários isquêmicaai os compostos no meio de cultura, esta técnica também tem sido utilizado em vários estudos de biologia de desenvolvimento para examinar os mecanismos de desenvolvimento únicos em mamíferos ^2-4. Por exemplo, o CME é combinado com outras técnicas, tais como a marcação celular, no tipo selvagem e mutantes embriões utilizando corante fluorescente ^{5, 6,} o transplante de células, e introdução de genes através de lipofecção e ⁷ electroporação ^8-13.

Recentemente, na manipulação útero foi usado para analisar os processos de desenvolvimento em embriões de roedores em fases posteriores e foi combinado com as técnicas de electroporação ^14-16. No entanto, estas técnicas não são adequadas para a manipulação de pós-implantação e midgestation embriões, devido à dificuldade em atingir o local de injecção exacta da solução de ADN em embriões nas fases iniciais. Embora o transplante de células guiadas por ultra-som e injeção de vetores virais em embriões (ie, Têm sido relatados E8.5-E-9.5 no mouse) no útero previamente ^17,18, excelentes habilidades são necessários para realizar esses experimentos com uma elevada taxa de sucesso. Portanto, o CME com elevada acessibilidade ex vivo tem vantagens no que diz respeito à manipulação de embriões de ratinho e de rato.

Centrifugadas imediatamente (IC) soro de rato preparada a partir de ratos machos é usado frequentemente para o meio WEC. Quando os embriões são cultivados na fase de pós-implantação (ou seja, mais cedo do que E8.0 no rato ou no rato E10.0), uma mistura de meio sintético e IC de soro de rato é frequentemente utilizado como um meio para WEC ^19. No entanto, a cultura de embriões em meados de gestação (ou seja., E8.0-12.5 em embriões de camundongos ou E10.0-E14.5 em embriões de ratos), com 100% de soro deve ser usado como um meio, porque nenhuma mídia alternativa disponível atualmente permite embriões para crescer normalmente in vitro durante mais de 2 dias.

A preparação do soro de rato de alta qualidade éum passo fundamental para alcançar reprodutibilidade nos experimentos do CME. Comparado a centrifugação retardada, IC tem a vantagem de reduzir a hemólise, quando o soro é recolhido por aperto do coágulo de fibrina, porque a maior parte dos glóbulos vermelhos já têm sido separado do coágulo de fibrina. Como soro de rato hemolítico não suporta o crescimento normal de embriões de rato e de ratinho, a preparação do soro usando centrifugação imediata é preferível para a preparação usando centrifugação retardada. Nosso protocolo contém dois passos adicionais, em comparação com outros protocolos de ^18-20 (ou seja., Armazenar o sangue recolhido em gelo antes da primeira centrifugação e mantendo as amostras de sangue recolhidas durante 2 horas a 4 ° C após a primeira centrifugação). A etapa anterior pode atrasar a formação do coágulo de sangue, e o último passo promove a solidificação do coágulo de fibrina para fácil espremer. Por isso, o nosso protocolo pode ser utilizado por principiantes. No entanto, a coleta de sangue e soro reproduzindoextração de precisão, simplesmente referindo-se a livros de protocolo é extremamente difícil ^19-21. Neste artigo de vídeo, demonstramos nosso protocolo padrão para a preparação de IC óptima de soro de rato, que inclui a recolha de sangue a partir da aorta abdominal de ratos machos e de extracção do soro por centrifugação.

Protocol

NOTA: Experimentos em animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Comitê de Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Tohoku aprovou os procedimentos experimentais aqui descritos. 1. Anestesia e Laparotomia Para a coleta de sangue, usar ratos machos específicos isentos de agentes patogénicos Sprague-Dawley. Rápido os ratos, pelo menos,…

Representative Results

A Figura 1 mostra os resultados representativos dos procedimentos descritos para a separação das células do sangue e do soro. Nós normalmente obter 15 ml de sangue a partir de um rato macho reformado (Figura 1A). Por centrifugação, o sangue recolhido pode ser separada numa camada superior que contém o soro e o coágulo de fibrina, o qual é indicado com uma seta, e uma camada inferior contendo células de sangue (Figura 1C). Importante, as amostras de sangue não…

Discussion

Resultados reprodutíveis em experiências CME são dependentes da utilização de alta qualidade IC de soro de rato e precisas técnica de dissecção embrião ^3. Não encurte o período de jejum antes de coletar o sangue, porque o jejum é necessário padronizar as concentrações de glicose no sangue. Os ratos fêmea não deve ser utilizado para a preparação do soro, porque os níveis de hormona de alterar em animais do sexo feminino de acordo com o ciclo estral, e tais variações de hormonas estradiol …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Abbott	B506	For anesthesia of rats.
Large scissors	Napox	B-7H	Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.
Curved forceps	Napox	A-3-2	Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat	Charles Rivers Laboratories		Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml)	TERUMO	SS-29ESZ
Needle (21G x 5/8")	TERUMO	NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml)	ASIAKIZAI	1101C000B-10	For collection of boold
Sterile disposable pipette	Eiken Chemical	CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)	Falcon	2196