Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Una varietà di modelli animali sono utilizzati in biologia dello sviluppo per studiare meccanismi di sviluppo a livello molecolare e cellulare. Ad esempio, anfibi e aviarie sono stati ampiamente usati come animali modello classico che sono adatti per la manipolazione diretta di embrioni perché questi embrioni si sviluppano al di fuori della madre. In contrasto con questi animali, embrioni mammiferi crescono nell'utero della madre, e la crescita in fasi successive è strettamente dipendente dalla funzione dell'utero. Pertanto, è tipicamente difficile da manipolare direttamente embrioni di mammifero come quelli di topo e nel ratto nelle fasi iniziali. Nel 1960, Denis New istituito un mammifero intera coltura degli embrioni (WEC), tecnica che utilizza apparecchiature WEC con un apporto di ossigeno continuo e controllo di calore 1. In WEC, topo e ratto embrioni possono crescere ex vivo (cioè, al di fuori dell'utero). Anche se la tecnica del WEC è stato spesso utilizzato in teratologia con l'aggiunta di vari chemicAl composti nel terreno di coltura, questa tecnica è stata utilizzata anche in diversi studi di biologia dello sviluppo per esaminare unici meccanismi di sviluppo nei mammiferi 2-4. Ad esempio, WEC è combinata con altre tecniche, quali l'etichettatura delle cellule, in wild-type e mutanti embrioni utilizzando colorante fluorescente 5, il trapianto di cellule 6, e l'introduzione del gene via lipofezione 7 ed elettroporazione 8-13.
Recentemente, in manipolazione utero è stato utilizzato per analizzare i processi di sviluppo in embrioni di roditori in fasi successive ed è stato combinato con tecniche di elettroporazione 14-16. Tuttavia, queste tecniche non sono adatti per la manipolazione di postimpianto e midgestation embrioni causa di difficoltà a raggiungere iniezione locale accurata della soluzione di DNA in embrioni nelle fasi iniziali. Sebbene il trapianto di cellule eco-guidata e l'iniezione di vettori virali in embrioni precoci (cioè, Sono stati segnalati E8.5-E-9.5 nel topo) in utero precedentemente 17,18, ottime capacità sono necessarie per eseguire questi esperimenti con un alto tasso di successo. Pertanto, WEC con alta accessibilità ex vivo ha dei vantaggi rispetto alla manipolazione di topo e ratto embrioni.
Subito centrifugati (IC) siero di ratto preparati da ratti maschi è spesso usato per le medie WEC. Quando gli embrioni sono coltivate nella fase post-impianto (cioè, prima del E8.0 nel topo o E10.0 nel ratto), una miscela di terreno sintetico e siero di ratto IC viene spesso usata come mezzo per WEC 19. Tuttavia, per gli embrioni di cultura a metà della gestazione (cioè., E8.0-12.5 in embrioni di topo o E10.0-E14.5 in embrioni di ratto), siero al 100% dovrebbe essere utilizzato come mezzo perché nessun media alternativi attualmente disponibili consentono embrioni a crescere normalmente in vitro per più di 2 giorni.
La preparazione del siero di ratto di alta qualità èun passo fondamentale per il raggiungimento riproducibilità negli esperimenti WEC. Rispetto a centrifugazione differite, IC ha il vantaggio di ridurre emolisi quando il siero viene raccolto comprimendo il coagulo di fibrina perché la maggior parte dei globuli rossi sono stati già separato dal coagulo di fibrina. Come siero di ratto emolitica non riesce a sostenere la crescita normale di ratto e di topo embrioni, preparazione del siero utilizzando immediata centrifugazione è preferibile preparato utilizzando centrifugazione ritardato. Il nostro protocollo contiene due passaggi aggiuntivi rispetto ad altri protocolli 18-20 (es., Conservare il sangue raccolto in ghiaccio prima della prima centrifugazione e mantenere i campioni di sangue raccolti per 2 ore a 4 ° C dopo la prima centrifugazione). Il primo passo può ritardare la formazione del coagulo di sangue, e quest'ultimo passo promuove la solidificazione del coagulo di fibrina per facile spremitura. Pertanto, il nostro protocollo può essere utilizzato da principianti. Tuttavia, la riproduzione di raccolta del sangue e sieroestrazione con precisione semplicemente facendo riferimento ai libri di protocollo è estremamente difficile 19-21. In questo articolo video, dimostriamo il nostro protocollo standard per la preparazione di siero ottimale ratto IC, che comprende la raccolta di sangue dall'aorta addominale di ratti maschi e estrazione del siero mediante centrifugazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Risultati riproducibili in esperimenti WEC dipendono l'uso di siero di ratto IC alta qualità e accurata tecnica embrione dissezione 3. Non accorciare il periodo di digiuno prima del prelievo del sangue, perché il digiuno è necessario standardizzare le concentrazioni di glucosio nel sangue. Ratti femmina non devono essere utilizzati per la preparazione di siero perché i livelli ormonali cambiano in femmine secondo il ciclo estrale, e tali cambiamenti di ormoni estradiolo non sono adatti per colture emb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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