הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
מגוון רחב של בעלי חיים משמשים מודל בביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנוני התפתחות ברמות מולקולריות ותאיות. לדוגמא, מין דו חיים ועופות היה בשימוש נרחב כמו חיות מודל קלאסיות המתאימים למניפולציה ישירה של עוברים, כי העוברים האלה להתפתח מחוץ של האם. בניגוד לבעלי חיים אלה, עוברי יונקים גדלים ברחמה של האם, וצמיחה בשלבים מאוחר יותר היא מכריע תלויה בתפקוד של הרחם. לכן, קשה בדרך כלל כדי לתפעל ישירות עוברי יונקים כגון אלה מהעכבר והחולדה בשלבים מוקדמים. ב 1960s, דניס החדש הוקם תרבות עובר כל יונקים טכניקה (WEC) באמצעות מנגנוני WEC עם אספקת חמצן רציפה ובקרת חום 1. בWEC, עוברי עכבר וחולדה יכולים לגדול vivo לשעבר, (כלומר, מחוץ לרחם). למרות טכניקת WEC שימשה לעתים קרובות בטרטולוגיה ידי הוספת chemic השוניםאל תרכובות לתוך מדיום התרבות, טכניקה זו שימשה גם במחקרים בביולוגיה התפתחותית שונים לבחון מנגנוני התפתחות ייחודיים ביונקים 2-4. לדוגמא, WEC הוא בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיוג תא, בעוברי wild-type ו מוטציה באמצעות צבע פלואורסצנטי 5, תא השתלה 6, והכנסת גן באמצעות lipofection 7 וelectroporation 8-13.
לאחרונה, במניפולציה ברחם כבר בשימוש כדי לנתח תהליכים התפתחותיים בעוברי מכרסמים בשלבים מאוחר יותר וכבר בשילוב עם טכניקות electroporation 14-16. עם זאת, שיטות אלו אינן מתאימות למניפולציה של עוברי postimplantation וmidgestation בשל קשיי השגת הזרקה מקומית מדויקת של פתרון ה-DNA לעוברי בשלבים המוקדמים. למרות שהשתלת תאי אולטרסאונד מונחה והזרקה של וקטורים ויראליים לעוברי מוקדמים (כלומר, דווח E8.5-E-9.5 בעכבר) ברחם בעבר 17,18, כישורים מעולים נדרשים לבצע ניסויים אלה עם שיעור הצלחה גבוה. לכן, יש WEC עם נגישות גבוהה vivo לשעבר יתרונות ביחס למניפולציה של עוברי עכבר וחולדה.
סרום החולדה centrifuged מייד (IC) שהוכן מחולדות זכרים משמש לעתים קרובות למדיום WEC. כשהם עוברים בתרבית בשלב postimplantation (כלומר, מוקדם יותר מאשר E8.0 בעכבר או E10.0 בחולדה), תערובת של מדיום סינטטי וסרום עכברוש IC משמש לעתים קרובות כאמצעי לWEC 19. עם זאת, לעוברי תרבות באמצע ההריון (כלומר., E8.0-12.5 בעוברי עכבר או E10.0-E14.5 בעוברי עכברים), יש להשתמש בסרום 100% כמדיום כי אף מדיה חלופית זמינה כרגע מאפשרת עוברים לגדול בדרך כלל במבחנה במשך יותר מ 2 ימים.
הכנת סרום עכברים באיכות גבוהה היאצעד קריטי להשגת שחזור בניסויי WEC. בהשוואה לצנטריפוגה מתעכבת, IC יש את היתרון של הפחתת המוליזה כאשר הסרום נאסף על ידי סחיטת קריש הפיברין כי רוב תאי הדם האדומים כבר הופרדו מקריש הפיברין. כסרום חולדה המוליטית לא מצליח לתמוך בצמיחה התקינה של עוברי חולדה ועכבר, הכנת הסרום באמצעות צנטריפוגה המיידית עדיפה להכנה באמצעות צנטריפוגה מתעכבת. הפרוטוקול שלנו מכיל בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שני צעדים נוספים 18-20 (כלומר., אחסון הדם שנאסף על קרח לפני צנטריפוגה הראשונה ושמירה על דגימות דם שנאספו במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה הראשונה). הצעד לשעבר יכול לעכב את היווצרותם של קרישי הדם, והצעד האחרון מקדם את ההתמצקות של קריש הפיברין לסחיטה קלה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש על ידי מתחילים. עם זאת, איסוף דם להפקה או לסרוםמיצוי מדויק על ידי פשוט מתייחס לספרי פרוטוקול קשה מאוד 19-21. במאמר זה וידאו, אנחנו מדגימים הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו להכנת סרום האופטימלי IC חולדה, הכולל איסוף דם מאב העורקים בבטן של חולדות וחילוץ של הסרום על ידי צנטריפוגה גבריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוצאות לשחזור בניסויי WEC תלויות בשימוש בסרום באיכות גבוהה IC חולדה וטכניקה לנתיחה עובר מדויק 3. לא לקצר את תקופת צום לפני איסוף דם בגלל הצום יש צורך לתקנן ריכוזי הגלוקוז בדם. אין להשתמש בחולדות נקבות להכנת הסרום כי רמות הורמונים משתנות אצל בעלי חיים נקבה על פי מחז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
