Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d'embryons de mammifères entier
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Une variété de modèles animaux sont utilisés en biologie du développement pour étudier les mécanismes de développement aux niveaux moléculaires et cellulaires. Par exemple, les espèces d'amphibiens et d'oiseaux ont été largement utilisés comme animaux modèles classiques qui sont appropriés pour la manipulation directe d'embryons parce que ces embryons se développent en dehors de la mère. Contrairement à ces animaux, les embryons de mammifères se développent dans l'utérus de la mère, et la croissance à des stades ultérieurs dépend essentiellement de la fonction de l'utérus. Par conséquent, il est souvent difficile de manipuler directement les embryons de mammifères, tels que ceux de la souris et le rat à des stades précoces. Dans les années 1960, Denis New établi une culture d'embryons total de mammifère (CME) de la technique utilisant des appareils WEC avec un apport d'oxygène et d'un contrôle de chaleur 1. En WEC, souris et rats embryons peuvent se développer ex vivo, (c'est à dire, en dehors de l'utérus). Bien que la technique du CME a été souvent utilisé en tératologie en ajoutant divers chemiccomposés al dans le milieu de culture, cette technique a également été utilisée dans plusieurs études de biologie du développement à examiner les mécanismes de développement uniques chez les mammifères 2-4. Par exemple, le CME est combiné avec d'autres techniques, telles que le marquage cellulaire, dans le type sauvage et mutantes embryons en utilisant un colorant fluorescent 5, 6 transplantation de cellules, et l'introduction de gène par l'intermédiaire de lipofection et d'électroporation 7 13.8.
Récemment, dans la manipulation de l'utérus a été utilisé pour analyser les processus de développement des embryons de rongeurs à des stades ultérieurs et a été combiné avec des techniques d'électroporation 14-16. Cependant, ces techniques ne sont pas appropriées pour la manipulation de post-implantation d'embryons et midgestation raison de la difficulté à atteindre injection locale précise de la solution d'ADN dans des embryons à un stade précoce. Bien que la transplantation de cellules guidée par ultrasons et l'injection de vecteurs viraux dans des embryons précoces (à savoir, E8.5-E-9.5 chez la souris) in utero ont été rapportés précédemment 17,18, d'excellentes compétences sont nécessaires pour effectuer ces expériences avec un taux de réussite élevé. Par conséquent, le WEC avec une grande accessibilité ex vivo présente des avantages par rapport à la manipulation de la souris et du rat des embryons.
Immédiatement centrifugé (IC) de sérum de rat préparée à partir de rats mâles est souvent utilisé pour les moyennes du CME. Lorsque les embryons sont mis en culture au stade de la post-implantation (par exemple, plus tôt que E8.0 chez la souris E10.0 ou chez le rat), d'un mélange de milieu synthétique et du sérum de rat IC est souvent utilisé comme un moyen pour WEC 19. Cependant, les embryons de la culture à la mi-gestation (c'est à dire., E8.0-12.5 dans des embryons de souris E10.0 ou E14.5-dans des embryons de rat), 100% de sérum doit être utilisé comme un moyen car aucune médias alternatifs actuellement disponibles permet embryons de se développer normalement in vitro depuis plus de 2 jours.
La préparation de sérum de rat de haute qualité estune étape cruciale pour atteindre la reproductibilité des expériences WEC. Par rapport à une centrifugation retardée, IC a l'avantage de réduire l'hémolyse lorsque le sérum est recueilli en serrant le caillot de fibrine parce que la plupart des cellules rouges du sang ont déjà été séparé du caillot de fibrine. Comme le sérum de rat hémolytique ne parvient pas à soutenir la croissance normale des embryons de rats et de souris, la préparation du sérum par centrifugation immédiate est préférable de préparation en utilisant la centrifugation retardée. Notre protocole comprend deux étapes supplémentaires par rapport à d'autres protocoles de 18 à 20 (c.-à-., Stocker le sang recueilli sur de la glace avant la première centrifugation et de maintenir les échantillons de sang prélevés pendant 2 heures à 4 ° C après la première centrifugation). L'ex-étape peut retarder la formation du caillot de sang, et la dernière étape favorise la solidification du caillot de fibrine pour la compression simple. Par conséquent, notre protocole peut être utilisé par les débutants. Toutefois, la reproduction et la collecte de sérum sanguinextraction avec précision par simple référence aux livres de protocole est extrêmement difficile 19-21. Dans cet article, vidéo, nous démontrons notre protocole standard pour la préparation de sérum de rat IC optimal, qui comprend la collecte de sang à partir de l'aorte abdominale de rats mâles et extraction du sérum par centrifugation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des résultats reproductibles lors des expérimentations WEC dépendent de l'utilisation de sérum de rat IC de haute qualité et de précision technique embryon de dissection 3. Ne pas raccourcir la période de jeûne avant la collecte de sang, car le jeûne est nécessaire de normaliser les concentrations de glucose dans le sang. Des rats femelles doivent pas être utilisés pour la préparation de sérum parce que les niveaux d'hormones chez les animaux femelles changent en fonction du cycle oestra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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