哺乳類の全胚培養に適したラット血清の調製
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
モデル動物種々の分子および細胞レベルでの発達のメカニズムを調べるために発生生物学において使用される。例えば、両生類や鳥類は、広くこれらの胚が母親の外側を開発するための胚を直接操作するのに適している古典的なモデル動物として使用されている。これらの動物とは対照的に、哺乳類の胚は母親の子宮で成長し、後の段階での成長は、子宮の機能に決定的に依存している。したがって、そのような直接早い段階でのマウスおよびラット由来のもののような哺乳動物の胚を操作するために、典型的には困難である。 1960年代には、デニスの新連続酸素供給や熱制御1とWECの装置を用いて哺乳動物全胚培養（WEC）の手法を確立した。 WECでは、マウスおよびラットの胚は、生体外 （ すなわち、子宮の外側）に成長することができます。 WECの技術は、多くの場合、様々なchemicを添加することによって奇形学において使用されたがらは、培養培地中に化合物が、この技術はさらに、哺乳動物2-4の固有の発達のメカニズムを調べるために、種々の発生生物学研究に使用されている。例えば、WECは、蛍光色素5、細胞移植6、および7リポフェクションおよびエレクトロ8-13を介して遺伝子導入を用いて、野生型及び変異胚におけるこのような細胞標識のような他の技術と組み合わされる。
近年、 子宮操作の後の段階でげっ歯類の胚における発生過程を分析するために使用されており、エレクトロポレーション技術14-16と組み合わされている。しかしながら、これらの技術は、初期の段階で胚にDNA溶液の正確な局所注射を達成する困難さに起因し、妊娠中期の胚の着床後の操作には適していない。初期胚への超音波ガイド下細胞移植およびウイルスベクターの注入が（ すなわち、子宮内でマウスE8.5-E-9.5）は、以前に17,18に報告されている、優れたスキルが高い成功率でこれらの実験を行うために必要とされる。したがって、高いアクセシビリティエクスビボでWECは、マウスおよびラット胚の操作に対して利点を有する。
雄性ラットから調製し、直ちに遠心分離した（IC）ラット血清は、多くの場合、WEC媒体に使用される。胚（ すなわち、ラット又はマウスE10.0においてE8.0より以前）着床後の段階で培養すると、合成培地およびICラット血清の混合物はしばしばWEC 19のための媒体として使用される。全く、現在入手可能な代替メディアが許さないので、妊娠中期での培養胚（ すなわち 、E8.0-12.5マウス胚またはラット胚におけるE10.0-E14.5）で、100％の血清を培地として使用する必要があります胚は、2日以上、インビトロで正常に成長する。
高品質のラット血清の調製物であるWECの実験で再現性を達成するための重要なステップ。遅延遠心分離に比べて、ICは、赤血球の大部分が既にフィブリン塊から分離されているので、血清はフィブリン塊を圧搾することによって収集されるときに溶血を低減するという利点を有する。溶血性ラット血清、ラットおよびマウス胚の正常な成長を支えることができないように、即時の遠心分離を用いて血清の調製は、遅延された遠心分離を用いて調製することが好ましい。我々のプロトコルは、他のプロトコルに比べて2つの手順が含まれている18〜20（ すなわち 、前最初の遠心分離に氷上で採取した血液を貯蔵し、最初の遠心分離の後、4℃で2時間採取した血液サンプルを維持する）。前者のステップは、血栓の形成を遅らせることができ、後者のステップは、簡単にスクイズのため、フィブリン塊の凝固を促進する。そのため、我々のプロトコルは、初心者で使用することができます。しかし、採血し、血清を再生する単にプロトコルブックを参照することにより正確に抽出が19-21は非常に困難である。このビデオの記事では、我々は雄ラット、遠心分離により血清の抽出の腹部大動脈から採血を含み、最適なICのラット血清の調製のための私達の標準的なプロトコルを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
WECの実験における再現性のある結果は、高品質のICラット血清、正確胚解剖技法3を使用することに依存している。空腹時には、血液中のグルコース濃度を標準化する必要があるため、採血前に絶食期間を短くしないでください。ホルモンレベルが発情周期に係る雌の動物に変化するため、雌ラット血清の調製のために使用すべきではない、およびエストラジオールホルモンのこのよ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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