Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Hayvan modellerinde çeşitli moleküler ve hücresel düzeyde gelişim mekanizmaları incelemek için gelişim biyolojisi kullanılır. Örneğin, amfibi ve kuş türleri yaygın olarak bu embriyolar, annenin dışında geliştirmek için embriyo doğrudan manipülasyon için uygun olan klasik bir model hayvanları olarak kullanılmıştır. Bu hayvanların aksine, memeli embriyolar annenin rahmine büyür ve daha sonraki aşamalarda büyüme rahim fonksiyonu üzerinde en önemlisi bağlıdır. Bu nedenle, doğrudan bu tür erken aşamalarında, fare ve sıçandan gibi memeli embriyolar işlemek için, tipik olarak zordur. 1960 yılında, Denis Yeni bir sürekli oksijen kaynağı ve ısı kontrolü 1 ile WEC cihazları kullanarak bir memeli bütün embriyo kültürü (WEC) tekniği kurulmuştur. WEC, fare ve sıçan embriyolar ex vivo, (yani, rahim dışında) büyüyebilir. DEK teknik, çoğu zaman, çeşitli chemic eklenerek teratolojide kullanılmış olmasına rağmenal, kültür ortamı içine bileşikler bu teknik aynı zamanda, memelilerde 2-4 benzersiz gelişim mekanizmaları incelemek için çeşitli gelişim biyoloji çalışmalarda kullanılmıştır. Örneğin, DEK floresan boya 5, hücre nakli 6 ve 7 lipofeksiyon ve elektroporasyon 8-13 aracılığıyla gen giriş kullanarak, vahşi tip ve mutant embriyolar, hücre etiketleme gibi diğer tekniklerle ile birleştirilmiştir.
Son zamanlarda, utero manipülasyon sonraki aşamalarda kemirgen embriyo gelişim süreçlerini analiz etmek için kullanılır olmuştur ve elektroporasyon teknikleri 14-16 ile kombine edilmiştir. Ancak, bu teknikler erken aşamalarında embriyolara DNA solüsyonu doğru lokal enjeksiyonu elde zorluklar nedeniyle ve implantasyon sonrası midgestation embriyoların manipülasyonu için uygun değildir. Her ne kadar erken embriyo (içine ultrason eşliğinde hücre transplantasyonu ve viral vektörlerin enjeksiyon yani, E8.5-E-9.5 fare) rahimde daha önce 17,18, mükemmel becerileri yüksek bir başarı oranı ile bu deneyleri gerçekleştirmek için gerekli olan rapor edilmiştir. Bu nedenle, yüksek erişilebilirlik ex vivo DEK fare ve sıçan embriyo manipülasyonu ile ilgili avantajlara sahiptir.
Erkek sıçanlarda hazırlanabilir hemen santrifüje (IC) sıçan serum genellikle DEK ortamı için kullanılır. Embriyolar (sıçan, fare veya E10.0 E8.0 in daha önce, yani,) implantasyon sonrası aşamasında kültürlendiği zaman, sentetik orta ve IC sıçan serum oluşturduğu bir karışıma genellikle DEK 19 için bir araç olarak kullanılır. Hiçbir mevcut alternatif medya sağlar çünkü Ancak, orta-gebelikte kültür embriyoların (yani., E8.0-12.5 fare embriyoları veya sıçan embriyolarında E10.0-E14.5 in),% 100 serum aracı olarak kullanılması gerektiğini en fazla 2 gün boyunca in vitro olarak normal büyümeye embriyolar.
Yüksek kaliteli sıçan serum hazırlanmasıdırWEC deneylerde röprodüsibilitesini ulaşmak için kritik bir adımdır. Gecikmeli santrifüj ile karşılaştırıldığında, IC kırmızı kan hücrelerinin çoğu zaten fibrin pıhtısı ayrılmış çünkü serum fibrin pıhtısı sıkarak ulaşılınca hemoliz azaltma avantajına sahiptir. Hemolitik sıçan serum sıçan ve fare embriyo normal gelişimini desteklemek için başarısız olarak, hemen santrifüj kullanılarak serumun hazırlanması gecikmeli santrifüj kullanılarak hazırlanması tercih edilir. Bizim protokol diğer protokollere göre iki ek adımları içerir 18-20 (yani. Önce ilk santrifüj için buz üzerinde toplanan kan depolama ve ilk santrifüjlemeden sonra, 4 ° C 'de 2 saat boyunca, toplanan kan örnekleri bakımı). Eski adım kan pıhtısı oluşmasını geciktirebilir ve ikinci adım kolay sıkma için fibrin pıhtısının katılaşma teşvik etmektedir. Bu nedenle, bizim protokol başlayanlar tarafından kullanılabilir. Ancak, üreyen, kan toplama ve serumsadece protokol kitaplara bakarak doğru ekstraksiyon 19-21 derece zordur. Bu ekran yazıda, erkek farelerde ve santrifüj ile serum ekstraksiyon abdominal aort kan koleksiyonu içerir uygun IC sıçan serumu, hazırlanması için, standart protokol göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DEK deneylerde yeniden üretilebilir sonuçlar, yüksek kaliteli IC sıçan serumu ve doğru bir embriyo diseksiyon yönteminin 3 kullanımına bağlıdır. Açlık kan glukoz konsantrasyonları standardize etmek gerekli olduğundan kan toplama önce açlık süresini kısaltmak etmeyin. Hormon düzeyleri östrus döngüsü göre dişi hayvanlarda değiştirmek için dişi sıçanlar serum hazırlanması için kullanılmamalıdır, estradiol ve hormonlar gibi değişikliklerin embriyo kültürleri için uygun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
