Voorbereiding van de Rat Serum Geschikt voor zoogdieren Hele Embryo Cultuur
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Een verscheidenheid van model dieren worden gebruikt in ontwikkelingsbiologie ontwikkelingsstoornissen mechanismen te onderzoeken op moleculair en cellulair niveau. Zo hebben amfibieën en vogelsoorten wijd gebruikt als klassieke model dieren die geschikt zijn voor directe manipulatie van embryo's, omdat deze embryo's ontwikkelen buiten de moeder. In tegenstelling tot deze dieren, zoogdieren embryo groeien in de baarmoeder van de moeder en groei in latere stadia is sterk afhankelijk van de functie van de baarmoeder. Daarom is het meestal moeilijk direct manipuleren zoogdieren embryo zoals die van de muis en rat in een vroeg stadium. In de jaren 1960, Denis Nieuw vestigde een zoogdier hele embryo cultuur (WEC) techniek met behulp van WEC apparaten met een continue toevoer van zuurstof en warmte controle 1. In WEC, kunnen muizen en ratten embryo's groeien ex vivo, (dat wil zeggen, buiten de baarmoeder). Hoewel de WEC techniek werd vaak gebruikt in teratologisch door het toevoegen van verschillende chemical verbindingen in het kweekmedium is deze techniek ook gebruikt in verschillende ontwikkelingsbiologie studies unieke ontwikkeling bij zoogdieren 2-4 onderzocht. Zo wordt WEC gecombineerd met andere technieken, zoals mobiele etikettering in wild-type en mutant embryo met fluorescerende kleurstof 5, celtransplantatie 6 en genintroductie via lipofectie 7 en elektroporatie 8-13.
Recent, in utero manipulatie is gebruikt om de ontwikkeling in knaagdieren embryo's te analyseren in latere stadia en is gecombineerd met elektroporatie technieken 14-16. Echter, deze technieken zijn niet geschikt voor het manipuleren van postimplantatie en midgestation embryo door moeilijkheden bereiken nauwkeurige lokale injectie van het DNA-oplossing in embryo in een vroeg stadium. Hoewel echogeleide celtransplantatie en de injectie van virale vectoren in vroege embryo's (dat wil zeggen, E8.5-E-9.5 in de muis) in de baarmoeder zijn gemeld eerder 17,18, zijn uitstekende vaardigheden die nodig zijn om deze experimenten uit te voeren met een hoog slagingspercentage. Daarom WEC hoge toegankelijkheid ex vivo heeft voordelen met betrekking tot de manipulatie van muizen en ratten embryo.
Onmiddellijk gecentrifugeerd (IC) rat serum bereid uit mannelijke ratten wordt vaak gebruikt voor WEC medium. Wanneer embryo's gekweekt op postimplantatie stadium (eerder dan E8.0 in de muis of E10.0 in de rat), wordt een mengsel van synthetisch medium en IC rattenserum vaak gebruikt als een medium voor WEC 19. Echter, cultuur embryo tussentijdse zwangerschap (dwz., E8.0-12.5 in muisembryo's of E10.0-E14.5 embryo in ratten), 100% serum worden gebruikt als een medium omdat er geen beschikbaar alternatieve media kan embryo groeien normaal in vitro meer dan 2 dagen.
De bereiding van hoogwaardige serum rat iseen cruciale stap voor het bereiken van de reproduceerbaarheid in WEC experimenten. Vergeleken met vertraagde centrifugatie, IC heeft het voordeel van het verminderen hemolyse als het serum wordt verzameld door knijpen de fibrine klonter omdat de meeste van de rode bloedcellen reeds gescheiden van het fibrine stolsel. Zoals hemolytische rat serum niet aan de normale groei van rat en muis embryo ondersteunen, de bereiding van serum met onmiddellijke centrifugatie de voorkeur preparaat met vertraagde centrifugatie. Het protocol bevat twee extra stappen vergelijking met andere protocollen 18-20 (dwz. Vóór de eerste centrifugatie het verzamelde bloed op ijs opslaan en onderhouden van de bloedmonsters gedurende 2 uur bij 4 ° C na de eerste centrifugatie). De eerstgenoemde stap de vorming van bloedstolsel vertragen, en deze stap bevordert de stolling van het fibrine stolsel gemakkelijk knijpen. Daarom kan ons protocol worden gebruikt door beginners. Echter, het reproduceren van bloedafname en serumextractie nauwkeurig door simpelweg te verwijzen naar protocol boeken is uiterst moeilijk 19-21. In deze video artikel tonen we standaardprotocol voor de bereiding van optimale IC rat serum, die bloedinzameling omvat van de abdominale aorta van mannelijke ratten en extractie van het serum door centrifugatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reproduceerbare resultaten WEC experimenten afhankelijk van het gebruik van hoge kwaliteit IC rattenserum en nauwkeurige embryo dissectie techniek 3. Niet inkorten van de periode van vasten voor het verzamelen van bloed, want vasten is nodig om glucose concentraties te standaardiseren in het bloed. Vrouwelijke ratten niet worden gebruikt voor de bereiding van serum omdat hormoonspiegels aanpassen bij vrouwelijke dieren volgens het loopsheid en dergelijke veranderingen in estradiol hormonen ongeschikt voor emb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
