Een<em> Ex Vivo</em> Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Gewonde CNS axonen falen om zich te vernieuwen en vaak terug te trekken uit de buurt van het letsel plaats. Axonen gespaard van het initiële letsel kan later secundaire axonale degeneratie ondergaan. Gebrek aan groeikegel vorming regeneratie, en verlies van andere gemyeliniseerde axonen verhogingen in het ruggenmerg sterk beperkt neurologisch herstel na letsel. Om te beoordelen hoe het centrum van gemyeliniseerde axonen van het ruggenmerg reageren op letsel, ontwikkelden we een ex vivo levende ruggenmerg model gebruik te maken van transgene muizen die geel fluorescerend eiwit in axonen en een centraal en zeer reproduceerbare lasergeïnduceerde dwarslaesie te betuigen aan het lot van documenteren axonen en myeline (lipofiele fluorescerende kleurstof Nile Red) na verloop van tijd met behulp van twee-foton excitatie time-lapse microscopie. Dynamische processen zoals acute axonale verwonding, axonale retractie en myelinedegeneratie best bestudeerd in real-time. Echter, de niet-focale aard van kneuzingen gebaseerde verwondingen en bewegingsartefacten ondervondentijdens de in vivo ruggenmerg beeldvorming make differentiëren primaire en secundaire axonale letsels reacties met behulp van hoge resolutie microscopie uitdagend. De ex vivo ruggenmerg model beschreven nabootst verscheidene aspecten van klinisch relevante contusie / compressie-geïnduceerde axonale pathologieën zoals axonale zwelling, sferoïde vorming, axonale doorsnijding en peri-axonale zwelling verschaffen een bruikbaar model voor deze dynamische processen in real-time bestuderen. Grote voordelen van dit model zijn uitstekend tijdruimtelijk resolutie die differentiatie tussen de primaire belediging die direct verwondt axonen en secundaire letsel mechanismen maakt; gecontroleerde infusie reagentia direct aan het perfusaat baden het koord; precieze veranderingen van het milieu milieu (bijvoorbeeld calcium, natrium-ionen, bekend bijdragers aan axonale blessure, maar bijna onmogelijk om te manipuleren in vivo); en muizen modellen bieden ook een voordeel als ze de gelegenheid bieden om te visualiseren enmanipuleren genetisch geïdentificeerd celpopulaties en subcellulaire structuren. Hier beschrijven we hoe te isoleren en het beeld van de levende ruggenmerg van muizen tot dynamiek van acute axonale letsels vast te leggen.

Introduction

Degeneratie van axonen is een prominent oorzaak van morbiditeit zelfs diverse neurologische aandoeningen zoals neurotrauma, beroerte, auto-immune en neurodegeneratieve ziekten. Anders dan het perifere zenuwstelsel (PNS), centraal zenuwstelsel (CNS) axonen een beperkte regeneratiecapaciteit eenmaal gewonden door zowel intrinsieke als extrinsieke barrières (dwz remmende moleculen axonale groei geproduceerd gedurende littekenvorming en vrijgemaakt tijdens myelinedegeneratie) ^{1 -7.} Hoewel een aantal van deze belemmeringen zijn uitgebreid onderzocht, therapeutische interventies gericht op CNS axonale degeneratie te voorkomen, bevorderen robuuste axonale regeneratie, en het herstel van functionele connectively, beperkt blijven.

Axonen eenmaal gescheiden van hun soma ondergaan stereotiep werkwijze degeneratie genoemd Wallerian degeneratie die wordt gekenmerkt door axonaal opzwellen, sferoïde vorming en eventuele fragmentatie (beoordeeld ^8). Incontrast, de proximale stomp die in continuïteit met het soma van een doorgesneden perifere axon blijft, vormt een zwelling op zijn einde, sterft terug naar het dichtstbijzijnde knooppunt van Ranvier, en kan dan starten groeikegel vorming, een belangrijke voorwaarde die nodig is voor de daaropvolgende axonale regeneratie ^9-11. In tegenstelling, de proximale axonale uiteinden van veel centrale axonen Kenmerkende "endbulbs" of terugtrekking bollen, niet groei kegels gevormd en in plaats trekken weg van de verwonding waar ze blijven maanden na verwonding ^12-15. Naast de primaire axonale verwonding, kunnen extra axonale schade / verlies eveneens gebeuren axons die voornamelijk worden gespaard van de oorspronkelijke verwonding. Dit vertraagde axonaal verlies van aanvankelijk gespaard axonen wordt aangeduid als secundaire axonale degeneratie. Deze inherente respons van CNS axonen schade maakt functionele axonale regeneratie nog moeilijker doel te bereiken in de hersenen en het ruggenmerg.

Hoewel hallmarks van axonale schade (bv spheroïde vorming, retractie bollen) zijn goed gekarakteriseerd uit post-mortem weefsel en experimentele modellen van axonale degeneratie, heeft opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze dynamische processen is beperkt. De meeste van deze studies zich op statische eindpunt waarnemingen die inherent niet aan individuele axonale reacties in de tijd vast te leggen. Hoewel exogeen toegepaste axonale tracers zijn nuttig axonale reacties verduidelijken statische secties en tijdens live beeldvorming geweest, heeft de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde axonale markers sterk verbeterd ons vermogen om axonen in real time via fluorescentie microscopie visualiseren. Inderdaad, een rudimentaire rapport van Kerschensteiner en collega's eerste directe bewijs van axonale degeneratie en regeneratie voorzien in vivo gebruik Thy1 GFP-S muizen die groen fluorescerend eiwit coderen in subsets van neuronen die hun prognoses te sturen in de dorsale kolommen van de wervelkolomkoord ^16. Live beeldvorming benaderingen met behulp van twee foton laser scanning microscopie (TPLSM) en genetische fluorescerend eiwit etikettering van cellen van belang blijft om direct bewijs en mechanistisch inzicht te geven in vele uiteenlopende dynamische processen zoals axonale degeneratie, Ca ²⁺ signalering, axonale regeneratie, astrocyten fysiologie, microglia fysiologie, en de respons op letsel ^17-25.

In tegenstelling tot de neuronen, zeer weinig bekend van myeline op schadelijke stimuli in real-time. Myeline is een essentieel onderdeel van de witte stof geproduceerd en onderhouden door oligodendrocyten in het CZS en Schwann cellen in de PNS. Myeline isoleert 99% van het oppervlak van axonen en daarmee zorgt voor een hoge weerstand, lage capaciteit beschermend omhulsel dat een snelle en efficiënte saltatorische impuls vermeerdering, onlangs beoordeeld door Buttermore et al. ²⁶ ondersteunt. Om de dynamische respons van myeline schade we de solvatochrome, lipofiele vangenfluorescerende kleurstof Nile Red ^27. De solvatochrome eigenschappen van deze vitale vlek laten spectrale verschuivingen van haar emissiespectrum dat afhankelijk is van de fysisch-chemische omgeving ^28,29 is. Deze eigenschappen zijn nuttig om inzicht te krijgen in de mechanismen van axomyelinic letsel en kan worden gevisualiseerd met behulp van geschikt gekozen koudlichtspiegel en emissie-filters of opgelost met behulp van spectrale microscopie ^27. Bijvoorbeeld, Nile Red's emissiespectrum blauw verschoven in minder polaire lipide-rijke omgevingen zoals die gevonden in adipocyten en normale CNS myeline (piekemissie ~ 580-590 nm) ^27. In tegenstelling tot deze vitale kleurstof's emissiespectrum pieken op ~ 625 nm in endbulbs gevormd als axonen ondergaan axonale dieback ^27. Hoewel de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectrale verschuivingen specifiek in endbulbs versus normale myeline onduidelijk blijven, kunnen dergelijke spectrale veranderingen onderliggende veranderingen in eiwitaccumulatie of desorganisatie leidt tot onthullenblootstelling van hydrofobe bindingsplaatsen ^27.

Terwijl in vivo beeldvorming de ultieme criterium voor het waarnemen ruggenmerg axonale letsels dynamiek in hun eigen omgeving, is het technisch moeilijk en aanzienlijke chirurgische deskundigheid vereist en vaak herhalen operaties aan de dorsale kolom die experimentele artefacten kunnen introduceren blootgesteld (bijvoorbeeld ontsteking en littekenvorming vorming). Daarnaast wordt kostbare apparatuur vaak nodig om ophanging en positionering van een intact dier onder de microscoop objectief mogelijk. De dieren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd en te zorgen dat ze blijven warm, om ervoor te zorgen vloeistoffen worden bijgevuld, en om ervoor te zorgen dat er geen tekenen van hypoxie als gevolg van langdurige narcose beeldvorming sessies. Het laatste is buitengewoon belangrijk als axonen en myeline absoluut vereist constante perfusie en voldoende zuurstof om levensvatbaar te blijven. Echter vaak niet gerapporteerd of gemonitord meeste in vivo studiesdate. Daarnaast beweging artefacten als gevolg van de hartslag en de ademhaling (isofluraan verdoofd volwassen muis: ~ 300-450 slagen per minuut (BPM) is optimaal tot 97-98% zuurstofverzadiging (normaal tarief ~ 632 BPM) en onderhouden van ~ 55-65 ademhalingen per min (normaal tarief is ~ 163 ademhalingen per minuut), respectievelijk)) ³⁰ tegengekomen tijdens in vivo ruggenmerg beeldvorming make differentiëren primaire en secundaire axonale letsels reacties met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie uitdagend als zelfs de snelste laser scans onvermijdelijk zijn onderworpen aan deze beweging artefacten. Vooruitgang in ultrasnelle resonante scanners gecombineerd met een implanteerbare stijve vertebrale frame venster kan beeldvorming van de muis ruggenmerg in wakkere dieren toelaten, maar snellere cyclustijden onvermijdelijk de signaal-ruisverhouding beelddegraderende minder worden. Verdere verbeteringen in het ruggenmerg beeldvormende technieken zoals die momenteel worden gebruikt voor beeldvorming van de hersenen kunnen veel van deze obstakels te overwinnen en te beperken potentiële verwart geïntroduceerd door inadequate weefsel perfusie, bijvoorbeeld, ^31-33.

Veel van wat er bekend is over materie fysiologie en mechanismen van stof schade wit wit is bepaald met behulp van in vitro of ex vivo voorbereidingen van de witte stof van de oogzenuw, perifere zenuwen en stroken van het ruggenmerg witte stof ^34-41. Deze preparaten blijven onze kennis van witte stof schade mechanismen vooruit als zij toestaan ​​gecontroleerde veranderingen in omgevingsfactoren, gecontroleerde toepassing van drugs en reagentia, functionele evaluaties met behulp van elektrofysiologie en directe fluorescentie microscopie observaties van axonen en myeline in levend weefsel. Toch een aantal eerdere benaderingen van axonen van het ruggenmerg dorsale kolom stroken of ventrale witte stof stroken in acht onvermijdelijk verwonden oppervlak axonen tijdens het verwijderen stadium dat de reactie van de voet tegen axonen kunnen beïnvloeden. Om te profiteren van de experimentele manipulaties boven en schade te voorkomen aan de very vezels onderzochte, gebruiken we een ex vivo ruggenmerg model zoals het voorkomt direct contact van het dorsale aspect van het koord. Zo is de architectuur van de pia mater en aangrenzende oppervlakkige dorsale kolom axonen levensvatbaar en onverstoord blijven tijdens isolatie.

Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige benadering die directe visualisatie centrale gemyeliniseerde axonen ze dynamisch reageren op een focaal letsel realtime tot 8 laat – 10+ uur na verwonding. De lasergeïnduceerde dwarslaesie (LISCI) model maakt onderscheid tussen primaire en secundaire axonale letsels mechanismen als de primaire laesie (ablatie ter plaatse) blijft ruimtelijk beperkt in de tijd. De open-bad beeldvorming kamer is toegankelijk voor therapeutische interventie, reagens levering, en milieu-manipulaties. Vermeende axomyelinic beschermende middelen kunnen snel worden beoordeeld in real-time door directe waarnemingen versus langdurige en kostbare experimenten met weefsel procesing, snijden, immunokleuring, het vastleggen van beelden, en de analyse en biedt daarom een ​​bruikbaar surrogaat model om acute reacties en beschermende manipulaties beoordelen voordat het testen van de experimentele agenten in levende dieren.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in het kader van richtlijnen die door de Institutional Animal Care en gebruik commissie aan de Universiteit van Louisville ingesteld, die vastzit aan federale regelgeving. 1. Bereiding van Laag Ca2 + en 2 mM Ca2 + Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) Perfusates Bereid 2x lage Ca 2+ (0,1 mM) Stock C buffer, 2x normale Ca 2+ (2 mm) Stock Een buffer, en 2x Stock B buffer z…

Representative Results

Details van een geschikt laboratoriumopstelling nodig isoleren, onderhouden levensvatbaarheid en het ex vivo ruggenmerg wordt getoond in figuur 1. De microscoop uitgerust te zijn met een afstembare gepulseerde femtosecondelaser passende dicroics en emissiefilters, en een water- dompelen objectief met een hoge numerieke apertuur (≥1.0). Om de levensvatbaarheid van het ruggenmerg te verzekeren tijdens de dissectie, moet de procedure worden uitgevoerd in aanwezigheid van gekoelde geoxygeneerde l…

Discussion

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming ex vivo ruggenmerg gemyeliniseerde axonen (dwz fasciculus gracilis) in combinatie met een laser geïnduceerde ruggenmergletsel het dynamisch verloop van zowel primaire als secundaire gemyeliniseerde axonale degeneratie volgen over de tijd. Ex vivo beeldvorming van het oppervlak van het ruggenmerg overwint veel van de complicaties in verband met in vivo beeldvorming zoals bewegingsartefacten en het potentieel van de experimentator-geïnduc…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin