Un<em> Ex Vivo</em> Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Assoni SNC feriti non riescono a rigenerarsi e spesso ritrarre lontano dal luogo di ferita. Gli assoni risparmiati dalla lesione iniziale possono poi subire una degenerazione assonale secondaria. La mancanza di formazione cono di crescita, la rigenerazione, e la perdita di ulteriori proiezioni assonale mieliniche all'interno del midollo spinale limita notevolmente il recupero neurologico dopo un trauma. Per valutare come centrale mielinizzati assoni del midollo spinale rispondono al danno, abbiamo sviluppato un modello ex vivo che vive midollo spinale utilizzando topi transgenici che esprimono la proteina giallo fluorescente in assoni e una focale e lesioni del midollo spinale indotta da laser altamente riproducibile per documentare il destino di assoni e mielina (colorante fluorescente lipofila Nile Red) nel tempo utilizzando la microscopia a due fotoni di eccitazione time-lapse. Processi dinamici come lesioni acute assonale, retrazione assonale e mielinica degenerazione sono meglio studiati in tempo reale. Tuttavia, la natura non-focale delle lesioni basate contusione-e artefatti da movimento rilevatodurante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopio impegnativo. Il modello in vivo ex midollo spinale descritto qui imita alcuni aspetti di rilevanza clinica contusione / patologie assonale compressione indotta tra cui gonfiore assonale, formazione sferoide, transezione assonale, e peri-assonale gonfiore fornendo un modello utile per studiare questi processi dinamici in tempo reale. I principali vantaggi di questo modello sono eccellenti risoluzione spazio-temporale che permette la differenziazione tra l'insulto primario che danneggia direttamente gli assoni e dei meccanismi di lesioni secondarie; infusione controllata di reagenti direttamente al bagno perfusato il cavo; alterazioni precise del milieu ambientale (ad esempio, il calcio, ioni sodio, noti collaboratori di danno assonale, ma vicino impossibile da manipolare in vivo); e modelli murini offrono anche un vantaggio in quanto forniscono la possibilità di visualizzare emanipolare popolazioni di cellule geneticamente identificati e strutture cellulari. Qui, descriviamo come isolare e immagine vivente midollo spinale di topi per catturare dinamiche di danno assonale acuta.

Introduction

La degenerazione degli assoni è una causa importante di morbilità abbracciano diverse condizioni neurologiche tra cui neurotrauma, ictus, autoimmuni e malattie neurodegenerative. A differenza del sistema nervoso periferico (PNS), sistema nervoso centrale (SNC) assoni hanno una limitata capacità di rigenerare volta feriti causa sia barriere intrinseche ed estrinseche (cioè, molecole inibitrici della crescita assonale prodotti durante la formazione di cicatrici e liberato durante mielina degenerazione) ^{1 -7.} Sebbene molti di questi ostacoli sono stati ampiamente esplorato, interventi terapeutici mirati per prevenire CNS degenerazione assonale, promuovere la rigenerazione assonale robusto, e ripristinare connectively funzionale, restano limitati.

Gli assoni una volta separati dal loro soma subiscono un processo di degenerazione stereotipata nota come degenerazione walleriana che è caratterizzata da gonfiore assonale, formazione sferoidale ed eventuale frammentazione (rivisto in ^8). Incontrasto, il moncone prossimale che rimane in continuità con la soma di un assone periferiche transected, forma una tumefazione alla sua estremità, muore al nodo più vicino di Ranvier, e può quindi avviare la crescita formazione cono, un prerequisito vitale necessario per la successiva rigenerazione assonale ^9-11. Al contrario, le terminazioni degli assoni prossimali di molti assoni centrali caratteristica forma "endbulbs" o lampadine retrazione, non riescono a formare coni di crescita, e invece rientrare dal sito della lesione dove rimangono per mesi dopo l'infortunio ^12-15. Oltre al danno assonale primario, ulteriore danno assonale / perdita può verificarsi anche a assoni che sono stati in gran parte risparmiata dalla lesione iniziale. Questa perdita assonale ritardato di assoni inizialmente risparmiati viene definita degenerazione assonale secondaria. Questa risposta inerente assoni del SNC al danno rende la rigenerazione assonale funzionale un obiettivo ancora più difficile da raggiungere nel cervello e nel midollo spinale.

Anche se hallmarks di danno assonale (ad esempio, la formazione sferoide, lampadine di svincolo) sono state ben caratterizzate da tessuti post mortem e modelli sperimentali di degenerazione assonale, studio dei meccanismi molecolari alla base di questi processi dinamici è stato limitato. La maggior parte di questi studi si è basata su osservazioni endpoint statiche che non hanno di per sé di catturare singole risposte assonale nel tempo. Anche se esogeno applicate traccianti assonali sono stati utili a chiarire le risposte assoni dalle sezioni statiche e durante l'imaging dal vivo, la disponibilità di marcatori assonale geneticamente codificati ha notevolmente migliorato la nostra capacità di visualizzare assoni in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infatti, un rapporto seminale da Kerschensteiner e colleghi prima ha fornito prova diretta di degenerazione assonale e rigenerazione in vivo utilizzando topi Thy1 GFP-S che codificano la proteina fluorescente verde in sottoinsiemi di neuroni che inviano le loro proiezioni nelle colonne dorsali del midollocavo ^16. Immagini dal vivo utilizzando due approcci microscopia a scansione laser fotoni (TPLSM) e l'etichettatura proteina fluorescente genetico delle cellule di interesse continua a fornire prove dirette e comprensione meccanicistica in molti diversi processi dinamici come la degenerazione assonale, Ca ²⁺ segnalazione, la rigenerazione assonale, astrociti fisiologia, la fisiologia della microglia, e la risposta al danno ^17-25.

In contrasto con gli assoni, si sa molto poco di risposte mielina al danno in tempo reale. La mielina è una componente vitale della materia bianca prodotta e mantenuta da oligodendrociti nelle cellule del sistema nervoso centrale e di Schwann nel PNS. Mielina isola 99% della superficie di assoni e così facendo fornisce una elevata resistenza, bassa capacità rivestimento protettivo che supporta rapida ed efficiente propagazione dell'impulso saltatory, recentemente da Buttermore et al. ^26. Per catturare la risposta dinamica di mielina al danno si usa il solvatochromic, lipofilacolorante fluorescente Nile Red ^27. Le proprietà solvatochromic di questa macchia vitale permettono spostamenti spettrali del suo spettro di emissione che dipende sull'ambiente fisico-chimica ^28,29. Queste proprietà sono utili al fine di conoscere i meccanismi di danno axomyelinic e può essere osservata con dicroici adeguatamente selezionati e filtri di emissione o risolti usando la microscopia spettrale ^27. Ad esempio, lo spettro di emissione di Nile Red è blu-spostata in ambienti meno polari, ricchi di lipidi, come quelli trovati in adipociti e normale mielina del SNC (picco di emissione ~ 580-590 nm) ^27. Al contrario, i picchi dello spettro di emissione di questo colorante vitale a ~ 625 nm in endbulbs formate da assoni subiscono deperimento assonale ^27. Anche se il preciso meccanismo questi spostamenti spettrali specificamente in endbulbs rispetto mielina normale rimangono poco chiari, tali cambiamenti spettrali possono rivelare le alterazioni alla base di accumulo di proteine ​​o la disorganizzazione che porta aesposizione dei idrofobiche siti di legame ^{di 27.}

Mentre l'imaging in vivo è la metrica fondamentale per l'osservazione del midollo spinale dinamiche danno assonale nel loro ambiente nativo, è tecnicamente impegnativo e richiede competenza chirurgica notevole, e spesso ripetere ambulatori per esporre la colonna dorsale che può introdurre artefatti sperimentali (ad esempio, l'infiammazione e la cicatrice formazione). Inoltre, le apparecchiature costose è spesso necessario per permettere la sospensione e il posizionamento di un animale intatta sotto la lente obiettivo microscopio. Gli animali devono essere attentamente monitorati e per assicurare che rimangono caldo, al fine di garantire i fluidi sono reintegrati, e per assicurarsi che non ci sono segni di ipossia a causa di sessioni di imaging anestetizzati prolungati. Quest'ultimo è estremamente importante in quanto assoni e mielina assolutamente richiedono perfusione costante e livelli di ossigeno adeguati a rimanere vitale. Tuttavia, questo non è spesso segnalata o monitorato in più studi in vivo perdata. Inoltre, artefatti da movimento a causa della frequenza cardiaca e la respirazione (isoflurano anestetizzati topo adulto: ~ 300-450 battiti al minuto (BPM) è ottimale per mantenere la saturazione di ossigeno 97-98% (tasso normale di ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respiri al minuto (tariffa normale è ~ 163 respiri al minuto), rispettivamente)) ³⁰ incontrato durante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopia a fluorescenza impegnativo come anche le scansioni laser più veloci inevitabilmente sono soggetti a questi movimenti artefatti. I progressi nella ultraveloci scanner di risonanza combinate con un impiantabile vertebrale rigida finestra incorniciate può consentire l'imaging del midollo spinale murino in animali svegli, ma i tempi di scansione più veloce inevitabilmente ridurre il rapporto segnale rumore qualità dell'immagine degradanti. Ulteriori miglioramenti nelle tecniche di imaging del midollo spinale, come attualmente utilizzate per l'imaging cerebrale possono superare molti di questi ostacoli e di limitare le potenziali confonde introdotte dal inaperfusione tissutale dequate, ad esempio, ^31-33.

Molto di ciò che si conosce della sostanza bianca fisiologia e meccanismi di danno sostanza bianca è stato determinato utilizzando in vitro o ex vivo preparazioni di sostanza bianca dal nervo ottico, nervo periferico, e le strisce di midollo spinale sostanza bianca ^34-41. Queste preparazioni continuano ad avanzare la nostra conoscenza dei meccanismi di lesioni bianche importa quanto consentono cambiamenti di fattori ambientali, controllata di farmaci e reagenti, valutazioni funzionali utilizzando elettrofisiologia, e dirette osservazioni microscopia a fluorescenza di assoni e mielina nel tessuto vivo controllati. Eppure, alcuni approcci precedenti per osservare assoni da midollo spinale strisce colonna dorsale o strisce di sostanza bianca ventrale inevitabilmente ferire assoni superficie durante la fase di rimozione che possono influenzare la risposta degli assoni strettamente opposti. Per capitalizzare le manipolazioni sperimentali di cui sopra e di evitare danni alla vefibre Ry sotto inchiesta, usiamo un modello del midollo spinale cervicale ex vivo in quanto impedisce il contatto diretto della parte dorsale del cavo. Così, l'architettura della pia madre e adiacenti dorsali superficiali assoni colonna rimangono vitali e imperturbato durante l'isolamento.

Qui si descrive un approccio relativamente semplice che permette la visualizzazione diretta di assoni mielinizzati centrali come rispondono dinamicamente a una lesione focale in tempo reale fino a 8 – 10+ ore dopo l'infortunio. La lesione del midollo spinale (Lisci) Modello indotta da laser consente la differenziazione tra i meccanismi di danno assonale primarie e secondarie, come la lesione primaria (sito di ablazione) rimane spazialmente vincolate nel tempo. La camera di imaging open-bagno è accessibile a un intervento terapeutico, la consegna dei reagenti, e manipolazioni ambientali. Agenti protettivi axomyelinic putativi possono essere rapidamente valutati in tempo reale da osservazioni dirette contro gli esperimenti lunghi e costosi che coinvolgono processi tessutoING, sezionamento, immunostaining, l'acquisizione di immagini, e l'analisi e quindi fornisce un modello utile surrogato per valutare le risposte acute e manipolazioni di protezione prima di testare gli agenti sperimentali di animali vivi.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dal comitato Animal Istituzionale Cura e uso presso l'Università di Louisville, in osservanza delle disposizioni federali. 1. Preparazione di Low Ca 2+ e 2 mM Ca 2 + artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) Perfusates Preparare 2x bassa Ca 2+ (0,1 mM) Stock tampone C, 2x normale Ca 2+ (2 mM) Stock Un buffer, e tampone 2x Archivio B co…

Representative Results

Dettagli di un laboratorio appropriata stabilita necessarie per isolare, mantenere la vitalità, e l'immagine del midollo spinale ex vivo è mostrato in Figura 1. Il microscopio deve essere dotato di un laser pulsato a femtosecondi accordabile, dicroics appropriati e filtri di emissione, e acqua immersione lente obiettivo con un elevato apertura numerica (≥1.0). Per garantire la redditività del midollo spinale durante la dissezione, la procedura deve essere eseguita in presenza di refrig…

Discussion

Descriviamo un metodo dell'imaging ex vivo midollo spinale assoni mielinizzati (cioè, fasciculus gracile) combinata con una lesione del midollo spinale indotta da laser per studiare la progressione dinamica sia degenerazione assonale mieliniche primaria e secondaria nel tempo. Ex vivo immagini della superficie di midollo spinale supera molte delle complicazioni associate con l'imaging in vivo come artefatti di movimento e il potenziale di ipossia sperimentatore indotta durant…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin