Une<em> Ex Vivo</em> Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Axones du SNC blessés ne parviennent pas à se régénérer et se rétracter souvent loin de l'endroit de la blessure. Axones épargnés par la blessure initiale peuvent subir tard dégénérescence axonale secondaire. L'absence de formation du cône de croissance, la régénération et la perte de projections axonales myélinisées supplémentaires au sein de la moelle épinière limite grandement la récupération neurologique après une lésion. Pour évaluer dans quelle centrale axones myélinisés de la moelle épinière répondent à des blessures, nous avons développé un ex vivo modèle vivant de la moelle épinière en utilisant des souris transgéniques qui expriment la protéine fluorescente jaune dans les axones et un foyer et des blessures de la moelle épinière induite par laser hautement reproductible pour documenter le sort des axones et la myéline (lipophile colorant fluorescent rouge Nil) au fil du temps en utilisant excitation à deux photons time-lapse microscopie. Processus dynamiques tels que lésion aiguë axonale, la rétraction des axones et la dégénérescence de la myéline sont les mieux étudiés en temps réel. Cependant, la nature non-focal de blessures, fondé contusion-et artefacts de mouvement a rencontréin vivo au cours de la moelle épinière de l'imagerie marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l'aide de microscopie à haute résolution difficile. Le modèle ex vivo de la moelle épinière décrit ici imite plusieurs aspects de contusion / pathologies axonales cliniquement pertinentes induite compression y compris gonflement axonal, la formation sphéroïde, transection axonale, et péri-axonale gonflement fournir un modèle utile pour étudier ces processus dynamiques en temps réel. Les principaux avantages de ce modèle sont une excellente résolution spatio-temporelle qui permet la différenciation entre l'insulte primaire qui blesse directement axones et des mécanismes de blessures secondaires; perfusion contrôlée de réactifs directement au bain de perfusion le cordon; modifications précises du milieu de l'environnement (par exemple, le calcium, les ions sodium, contributeurs connus de lésions axonales, mais près impossible de manipuler in vivo); et des modèles murins offrent également un avantage car ils fournissent l'occasion de visualiser etmanipuler les populations de cellules génétiquement identifiés et structures sous-cellulaires. Ici, nous décrivons comment isoler et de l'image de la moelle épinière de souris vivant pour capturer la dynamique de lésions axonales aiguë.

Introduction

La dégénérescence des axones est une cause importante de morbidité couvrant plusieurs conditions neurologiques, y compris la neurotraumatologie, accident vasculaire cérébral, auto-immune, et les maladies neurodégénératives. Contrairement au système nerveux périphérique (SNP), système nerveux central (SNC) axones ont une capacité limitée de se régénérer une fois blessés en raison de deux obstacles intrinsèques et extrinsèques (ce est à dire, des molécules inhibitrices de la croissance axonale produite pendant la formation de cicatrice et libéré lors de la dégénérescence de la myéline) ^{1 -7.} Bien que plusieurs de ces obstacles ont été largement exploré, interventions thérapeutiques visant à prévenir CNS dégénérescence axonale, robuste promouvoir la régénération axonale, et restaurer connectively fonctionnelle, restent limités.

Axones fois séparés de leur soma subissent un processus stéréotypée de la dégénérescence connue sous le nom wallérienne dégénérescence qui se caractérise par un gonflement axonal, la formation et la fragmentation éventuelle sphéroïde (revue dans ^8). Encontraste, le moignon proximal qui reste dans la continuité avec le soma d'un axone périphérique sectionné, forme une enflure à son extrémité, meurt sur le nœud le plus proche de Ranvier, et peut alors initier la formation du cône de croissance, une condition essentielle nécessaire à la régénération axonale ultérieure ^9-11. En revanche, les terminaisons axonales proximales de nombreux axones centraux forment "endbulbs" caractéristiques ou des ampoules de rétraction, ne parviennent pas à former des cônes de croissance, et au lieu rétracter loin du site de la lésion où ils restent pendant des mois après une blessure ^12-15. En plus de la blessure axonale primaire, plus axonale dommages / perte peut également se produire aux axones qui ont été largement épargnés par la blessure initiale. Cette perte axonale tardive des axones initialement épargnées est appelée dégénérescence axonale comme secondaire. Cette réponse inhérente des axones du SNC d'une blessure rend la régénération axonale fonctionnelle un objectif encore plus difficile à réaliser dans le cerveau et la moelle épinière.

Bien hallmarks de lésions axonales (par exemple, la formation sphéroïde, ampoules de rétraction) ont été bien caractérisés à partir de tissus post-mortem et des modèles expérimentaux de dégénérescence axonale, l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces processus dynamiques a été restreint. La plupart de ces études se est appuyé sur les observations finaux statiques qui intrinsèquement échoué à capturer réponses axonales individuels au fil du temps. Bien appliquées de manière exogène traceurs axonales ont été utiles pour élucider réponses axonales des sections statiques et pendant l'imagerie en direct, la disponibilité de marqueurs axonales génétiquement codés a grandement amélioré notre capacité à visualiser axones en temps réel en utilisant la microscopie de fluorescence. En effet, un rapport séminal du Kerschensteiner et collègues ont d'abord fourni une preuve directe de la dégénérescence axonale et la régénération in vivo utilisant des souris Thy1 GFP-S qui codent pour une protéine fluorescente verte dans les sous-ensembles de neurones qui envoient leurs projections dans les colonnes dorsales de la moellecordon ^16. L'imagerie en direct approches utilisant deux microscopie à balayage laser de photons (TPLSM) et génétique fluorescente marquage des protéines de cellules d'intérêt continue de fournir une preuve directe et une approche mécanistique dans de nombreux processus dynamiques diverses telles que la dégénérescence axonale, Ca ²⁺ signalisation, la régénération axonale, astrocyte physiologie, la physiologie de la microglie, et la réponse à la blessure ^17-25.

Contrairement aux axones, on sait très peu de réponses de la myéline des blessures en temps réel. La myéline est une composante essentielle de la matière blanche produite et entretenue par les oligodendrocytes dans les cellules du système nerveux central et de Schwann dans le PNS. Myéline isole 99% de la surface des axones et, ce faisant fournit une haute résistance, faible capacité gaine protectrice qui soutient propagation de l'influx saltatoire rapide et efficace, a récemment examiné par Buttermore et al., ^26. Pour capturer la réponse dynamique de la myéline d'une blessure, nous utilisons le solvatochrome, lipophilecolorant fluorescent du Nil ²⁷ Rouge. Les propriétés de ce solvatochromes colorant vital permettent décalages spectraux de son spectre d'émission qui dépend de l'environnement physico-chimique ^28,29. Ces propriétés sont utiles pour mieux comprendre les mécanismes de blessure axomyelinic et peuvent être visualisées en utilisant convenablement choisis dichroïques et filtres d'émission ou résolus en utilisant la microscopie spectrale ^27. Par exemple, le spectre d'émission de rouge Nil est décalée vers le bleu dans des environnements moins polaires, riches en lipides tels que ceux trouvés dans les adipocytes et la myéline normale CNS (~ pic d'émission de 580 à 590 nm) ^27. En revanche, les pics du spectre d'émission de ce colorant vital à ~ 625 nm dans endbulbs formées comme des axones ²⁷ subissent un dépérissement axonale. Bien que les mécanismes précis qui sous-tendent ces décalages spectraux spécifiquement dans endbulbs contre la myéline normale restent floues, de telles modifications spectrales peuvent révéler des modifications sous-jacentes à l'accumulation de protéines ou de désorganisation conduisant àexposition des sites de liaison hydrophobes ^27.

Alors que l'imagerie in vivo est la métrique ultime pour observer la moelle épinière dynamique de lésions axonales dans leur environnement natif, il est techniquement difficile et nécessite une expertise chirurgicale importante, et répéter souvent chirurgies pour exposer la colonne dorsale qui peuvent introduire des artefacts expérimentaux (par exemple, l'inflammation et la cicatrice formation). En outre, un équipement coûteux est souvent nécessaire pour permettre la suspension et le positionnement d'un animal intact sous l'objectif de microscope. Les animaux doivent être soigneusement surveillés aussi bien pour se assurer qu'ils restent au chaud, pour assurer fluides sont reconstituées, et pour se assurer qu'il n'y a pas de signes d'hypoxie en raison de séances d'imagerie anesthésiés prolongées. Ce dernier point est extrêmement important que les axones et la myéline exigent absolument un niveau adéquat d'oxygène perfusion constante et de rester viable. Cependant, ce ne est souvent pas signalée ou contrôlée dans la plupart des études in vivo aujour. En outre, le mouvement artefacts dus à la fréquence cardiaque et de la respiration (isoflurane anesthésiés souris adulte: ~ 300-450 battements par minute (BPM) est optimale pour maintenir 97-98% de saturation en oxygène (normal taux ~ 632 BPM) et ~ 55-65 respirations par minute (taux normal est de ~ 163 respirations par minute), respectivement)) ³⁰ rencontrés lors in vivo moelle imagerie de cordon marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l'aide de haute résolution microscopie à fluorescence difficile que même les plus rapides balayages laser inévitablement soumis à ces mouvements artefacts. Les progrès de la ultrarapides scanners résonance combinés avec un vertébrale rigide fenêtre encadrée implantable peut permettre l'imagerie de la moelle épinière de souris chez les animaux éveillés, mais les temps de numérisation plus rapide réduisent inévitablement le rapport signal sur bruit qualité d'image dégradants. D'autres améliorations dans les techniques d'imagerie de la moelle épinière comme actuellement utilisés pour l'imagerie cérébrale peuvent surmonter nombre de ces obstacles et de limiter les facteurs de confusion potentiels introduits par l'INAdequate perfusion tissulaire, par exemple, ^{de 31 à 33.}

Une grande partie de ce qui est connu à propos de White physiologie et mécanismes des lésions de la substance blanche question a été déterminée en utilisant in vitro ou ex vivo des préparations de la substance blanche du nerf optique, nerf périphérique, et des bandes de la moelle épinière substance blanche ^34-41. Ces préparatifs se poursuivent pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de lésions de la substance blanche, car ils permettent des changements dans les facteurs environnementaux, de l'application contrôlée de médicaments et des réactifs, des évaluations fonctionnelles en utilisant électrophysiologie, et des observations de microscopie par fluorescence directs des axones et la myéline dans les tissus vivants contrôlés. Pourtant, certaines approches précédentes pour observer les axones de la moelle épinière bandes de colonne dorsale ou ventrale bandes de la substance blanche blesser inévitablement axones de surface lors de l'étape d'élimination qui peuvent influencer la réponse des axones près opposés. Afin de capitaliser sur les manipulations expérimentales ci-dessus et éviter d'endommager le vefibres ry objet d'une enquête, nous utilisons un modèle ex vivo col de l'utérus de la moelle épinière, car il empêche le contact direct de la face dorsale de la moelle. Ainsi, l'architecture de la pie-mère et les axones des colonnes adjacentes dorsales superficielle reste viable et imperturbable pendant l'isolement.

Nous décrivons ici une approche relativement simple qui permet la visualisation directe des axones myélinisés centrales car ils répondent dynamiquement d'une blessure focale en temps réel jusqu'à 8 – 10+ h après une blessure. La blessure de la moelle épinière (Lisci) modèle induit par laser permet la différenciation entre les mécanismes de lésions axonales primaires et secondaires que la lésion primaire (site d'ablation) reste spatialement limitées dans le temps. La chambre de l'imagerie en plein bain est accessible à une intervention thérapeutique, la livraison de réactifs et manipulations de l'environnement. Agents de protection axomyelinic putatifs peuvent être rapidement évaluées en temps réel par des observations directes contre des expériences longues et coûteuses impliquant processus de tissusING, le sectionnement, immunomarquage, capture d'image, et l'analyse et fournit donc un modèle de substitution utile pour évaluer les réponses aiguës et les manipulations de protection avant de tester les agents expérimentaux d'animaux vivants.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices fixées par le comité soin et l'utilisation institutionnelle animale de l'Université de Louisville, en adhérant à la réglementation fédérale. 1. Préparation de faible Ca 2+ et 2 mM de Ca 2+ liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) perfusats Préparer faible teneur en Ca 2+ (0,1 mm) C tampon 2x, 2x Ca normale 2+ (2 m…

Representative Results

Détails d'un laboratoire approprié mis en place nécessaire d'isoler, de maintenir la viabilité, et l'image l'ex vivo de la moelle épinière est montré à la figure 1. Le microscope doit être équipé d'un laser accordable pulsé femtoseconde, dicroics appropriées et filtres d'émission et une eau trempage objectif avec une ouverture numérique élevée (≥1.0). Pour assurer la viabilité de la moelle épinière lors de la dissection, la procédure doit être eff…

Discussion

Nous décrivons un procédé d'imagerie ex vivo de la moelle épinière axones myélinisés (c.-à faisceau gracile) associée à une lésion de la moelle épinière induite par laser pour étudier la progression dynamique de dégénérescence axonale myélinisées fois primaire et secondaire dans le temps. Imagerie ex vivo de la surface de la moelle épinière à bout de bien des complications associées à l'imagerie in vivo tels que les artefacts de mouvement et le potentie…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin