Una<em> Ex Vivo</em> Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Axones lesionados del SNC no se regeneran y, a menudo retraer lejos del sitio de la lesión. Los axones se salvaron de la lesión inicial más tarde pueden sufrir degeneración axonal secundaria. La falta de formación del cono de crecimiento, la regeneración, y la pérdida de proyecciones axonales mielinizadas adicionales dentro de la médula espinal limita en gran medida la recuperación neurológica después de una lesión. Para evaluar la forma en el centro de axones mielinizados de la médula espinal responden a las lesiones, hemos desarrollado un modelo ex vivo vivir médula espinal utilizando ratones transgénicos que expresan la proteína amarilla fluorescente en los axones y una focal y lesión medular inducida por láser altamente reproducible para documentar el destino de axones y mielina (colorante fluorescente lipofílica Rojo Nilo) con el tiempo utilizando excitación de dos fotones time-lapse microscopía. Los procesos dinámicos tales como lesión aguda axonal, la retracción axonal, y la degeneración de la mielina están mejor estudiados en tiempo real. Sin embargo, la naturaleza no focal de las lesiones a base de contusión y artefactos de movimiento encontródurante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria utilizando microscopía de alta resolución desafiante. El modelo ex vivo de la médula espinal aquí descrita replica varios aspectos de la contusión / patologías axonal clínicamente relevantes inducida por compresión, incluyendo inflamación axonal, la formación de esferoides, transección axonal, y peri-axonal hinchazón proporcionando un modelo útil para estudiar estos procesos dinámicos en tiempo real. Las principales ventajas de este modelo son una excelente resolución espacial y temporal que permite la diferenciación entre el insulto primaria que lesiona directamente los axones y los mecanismos de lesión secundaria; infusión controlada de reactivos directamente al baño perfundido el cable; alteraciones precisas del medio ambiente (por ejemplo, calcio, iones de sodio, los contribuyentes que se sabe que la lesión axonal, pero casi imposible de manipular en vivo); y modelos murinos también ofrecen una ventaja, ya que proporcionan la oportunidad de visualizar ymanipular las poblaciones de células identificadas genéticamente y estructuras subcelulares. A continuación, describimos cómo aislar e imagen viviente de la médula espinal de los ratones para capturar la dinámica de lesión axonal aguda.

Introduction

La degeneración de los axones es una causa importante de morbilidad que abarca varias condiciones neurológicas incluyendo neurotrauma, accidente cerebrovascular, enfermedades autoinmunes, y enfermedades neurodegenerativas. A diferencia del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) axones tienen una capacidad limitada para regenerar una vez heridos debido tanto a las barreras intrínsecas y extrínsecas (es decir, moléculas inhibidoras del crecimiento axonal producido durante la formación de la cicatriz y liberado durante la degeneración de mielina) ^{1 -7.} Aunque varias de estas barreras se han explorado ampliamente, las intervenciones terapéuticas dirigidas a prevenir CNS degeneración axonal, promover la regeneración axonal robusta, y restaurar connectively funcional, siguen siendo limitados.

Los axones una vez separados de su soma someten a un proceso estereotipada de la degeneración conocida como degeneración walleriana que se caracteriza por hinchazón axonal, la formación de esferoides y eventual fragmentación (revisado en ^8). EnPor el contrario, el muñón proximal que permanece en continuidad con el soma de un axón periférico seccionado, forma una hinchazón en su extremo, muere de nuevo al nodo más cercano de Ranvier y, a continuación puede iniciar la formación del cono de crecimiento, un requisito previo vital necesaria para la regeneración axonal subsiguiente ^9-11. En contraste, las terminaciones axonales proximales de muchos axones centrales forman "endbulbs" característicos o bombillas de retracción, no se forman conos de crecimiento, y en lugar de retraer lejos del sitio de la lesión donde permanecen durante meses después de la lesión ^12-15. Además de la lesión axonal primaria, daño axonal / pérdida adicional también puede ocurrir a los axones que se salvaron en gran parte de la lesión inicial. Esta pérdida axonal retraso de los axones librado inicialmente se denomina degeneración axonal como secundario. Esta respuesta inherente de los axones del SNC a una lesión hace que la regeneración axonal funcional un objetivo aún más difícil de lograr en el cerebro y la médula espinal.

Aunque hallmarks de lesión axonal (por ejemplo, la formación de esferoides, bombillas de retracción) han sido bien caracterizados a partir de modelos experimentales de la degeneración axonal tejido post-mortem y, elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos dinámicos ha sido restringido. La mayoría de estos estudios se basó en observaciones de punto final estáticas que intrínsecamente no lograron capturar respuestas axonal individuales en el tiempo. Aunque aplicadas exógenamente trazadores axonal han sido útiles para dilucidar las respuestas axonal de secciones estáticas y durante imágenes en vivo, la disponibilidad de marcadores axonal codificados genéticamente ha mejorado en gran medida nuestra capacidad de visualizar los axones en tiempo real, utilizando microscopía de fluorescencia. De hecho, un informe seminal de Kerschensteiner y colegas proporcionan primera evidencia directa de la degeneración axonal y la regeneración in vivo utilizando ratones Thy1 GFP-S que codifican la proteína fluorescente verde en subconjuntos de neuronas que envían sus proyecciones en las columnas dorsales de la médulacable de ^16. Imágenes en vivo enfoques utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (TPLSM) y genéticas etiquetado proteína fluorescente de células de interés continúa proporcionando evidencia directa y visión mecanicista en muchos diversos procesos dinámicos tales como la degeneración axonal, Ca ^{2 +} señalización, la regeneración axonal, la fisiología de los astrocitos, fisiología microglial, y la respuesta a la lesión ^17-25.

A diferencia de los axones, se sabe muy poco de las respuestas a la lesión de la mielina en tiempo real. La mielina es un componente vital de la sustancia blanca producida y mantenida por los oligodendrocitos en las células del sistema nervioso central y de Schwann en el SNP. La mielina aísla 99% de la superficie de los axones y de esta manera proporciona una alta resistencia, la cubierta protectora de baja capacitancia que soporta rápida y eficaz la propagación del impulso saltatoria, revisado recientemente por Buttimore et al., ^26. Para capturar la respuesta dinámica de la mielina a las lesiones usamos la solvatocrómico, lipófilocolorante fluorescente Nilo ²⁷ Red. Las propiedades solvatocrómico de este colorante vital permiten desplazamientos espectrales de su espectro de emisión que es dependiente del entorno físico-químico ^28,29. Estas propiedades son útiles para comprender mejor los mecanismos de lesión axomyelinic y pueden ser visualizados usando dicroicas adecuadamente seleccionados y filtros de emisión o resolverse mediante microscopía espectral ^27. Por ejemplo, el espectro de emisión del Rojo Nilo es desplazada al azul en entornos menos polares, ricas en lípidos tales como los encontrados en los adipocitos y la mielina del SNC normal (pico de emisión ~ 580-590 nm) ^27. En contraste, los picos del espectro de emisión de este colorante vital en ~ 625 nm en endbulbs formados como axones sufren muerte regresiva axonal ^27. Aunque los mecanismos exactos que subyacen a estos desplazamientos espectrales específicamente en endbulbs frente a la mielina normal, siguen sin estar claros, tales cambios espectrales pueden revelar alteraciones subyacentes en la acumulación de proteínas o desorganización que lleva ala exposición de sitios de unión hidrófobos ^27.

Mientras imágenes in vivo es la métrica final para la observación de la dinámica de la médula espinal de lesión axonal en su entorno nativo, es técnicamente difícil y requiere experiencia quirúrgica considerable y, a menudo repetir cirugías para exponer la columna dorsal que puede introducir artefactos experimentales (por ejemplo, la inflamación y la cicatriz formación). Además, un equipo costoso es a menudo necesaria para permitir la suspensión y posicionamiento de un animal intacto bajo la lente del objetivo de microscopio. Los animales deben ser supervisados ​​cuidadosamente, así como asegurar que se mantienen cálidas, para garantizar los líquidos se reponen, y para garantizar que no haya signos de hipoxia debido a las sesiones de formación de imágenes anestesiados prolongados. Esto último es muy importante como axones y mielina absolutamente requieren perfusión constante y los niveles de oxígeno adecuados para seguir siendo viable. Sin embargo, esto a menudo no se informó ni controlado en la mayoría de los estudios in vivo afecha. Además, los artefactos de movimiento debido a la frecuencia cardíaca y la respiración (isoflurano anestesiados ratón adulto: ~ 300 a 450 latidos por minuto (BPM) es óptima para mantener la saturación de oxígeno 97 a 98% (normal tasa de ~ 632 BPM) y ~ 55-65 respiraciones por minuto (tarifa normal es de ~ 163 respiraciones por minuto), respectivamente)) ³⁰ encontrados durante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución desafiante ya que incluso los más rápidos escaneos láser inevitablemente están sujetos a estos movimientos artefactos. Los avances en los escáneres de resonancia ultrarrápidos combinados con un vertebral rígida ventana enmarcada implantable puede permitir imágenes de la médula espinal murino en animales despiertos, pero los tiempos de exploración más rápido reducen inevitablemente la relación señal a ruido de calidad de imagen degradante. Otras mejoras en las técnicas de imagen de la médula espinal se utilizan en la actualidad para las imágenes cerebrales pueden superar muchos de estos obstáculos y limitar posibles confusiones introducidas por inala perfusión tisular dequate, por ejemplo, ^31-33.

Mucho de lo que se conoce sobre blanco fisiología y mecanismos de la lesión de la sustancia blanca cuestión se ha determinado utilizando in vitro o preparados ex vivo de la sustancia blanca del nervio óptico, el nervio periférico, y tiras de la médula espinal de la sustancia blanca ^34-41. Estas preparaciones continúan avanzar en el conocimiento de los mecanismos de lesión de la sustancia blanca, ya que permiten cambios en los factores ambientales, la aplicación controlada de fármacos y reactivos, evaluaciones funcionales utilizando electrofisiología, y observaciones de microscopía de fluorescencia directa de los axones y mielina en el tejido vivo controlados. Sin embargo, algunos de los enfoques anteriores para observar los axones de las tiras de la columna dorsal de la médula espinal o las tiras de materia blanca ventral inevitablemente dañar los axones superficiales durante la etapa de eliminación que pueden influir en la respuesta de los axones de cerca opuestos. Para sacar provecho de las manipulaciones experimentales anteriores y evitar daños en el cincofibras ry bajo investigación, utilizamos un modelo de la médula espinal cervical ex vivo, ya que evita el contacto directo de la cara dorsal de la médula. Por lo tanto, la arquitectura de la piamadre y axones columna dorsal superficial adyacentes permanecen viables e imperturbable durante el aislamiento.

Aquí se describe un enfoque relativamente simple que permite la visualización directa de los axones mielinizados centrales para que puedan responder dinámicamente a una lesión focal en tiempo real hasta 8 – 10+ horas después del daño. El modelo de lesión medular inducida por láser (Lisci) permite la diferenciación entre los mecanismos de lesión axonal primaria y secundaria como el (lugar de ablación) lesión primaria permanece espacialmente limitadas en el tiempo. La cámara de imágenes en baño abierto es accesible para la intervención terapéutica, la entrega de reactivos y manipulaciones ambientales. Agentes protectores axomyelinic putativos pueden ser evaluados rápidamente en tiempo real por observaciones directas frente a experimentos largos y costosos que implican proceso de tejidoing, seccionamiento, inmunotinción, captura de imágenes, y el análisis y por lo tanto proporciona un modelo sustituto útil para evaluar las respuestas agudas y manipulaciones de protección antes de probar los agentes experimentales en animales vivos.

Protocol

NOTA: Todos los animales procedimientos se realizaron bajo las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional de la Universidad de Louisville, conforme a las normativas federales. 1. Preparación de Baja Ca 2+ y 2 mM de Ca 2+ líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) perfundidos Preparar 2x bajo Ca 2 + (0,1 mM) Stock tampón C, 2x Ca normales 2+ (2 mM) Stock un tampón, y tampón 2x Stock B como …

Representative Results

Los detalles de un laboratorio adecuado establecido necesario para aislar, mantener la viabilidad, y la imagen de la médula espinal ex vivo se muestran en la Figura 1. El microscopio debe estar equipado con un láser sintonizable de impulsos de femtosegundo, dicroics apropiados y filtros de emisión, y un agua sumergiendo lente objetivo con una apertura numérica (≥1.0). Para asegurar la viabilidad de la médula espinal durante la disección, el procedimiento se debe realizar en la presencia…

Discussion

Se describe un método de formación de imágenes ex vivo de la médula espinal axones mielinizados (es decir, fascículo gracile) combinado con una lesión de la médula espinal inducida por láser para estudiar la dinámica de la progresión de la degeneración axonal tanto mielinizadas primaria y secundaria con el tiempo. Ex vivo de imágenes de la superficie de la médula espinal supera muchas de las complicaciones asociadas con la formación de imágenes in vivo tales como artefa…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin