Um<em> Ex Vivo</em> Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Axónios do SNC lesionados e não conseguem regenerar frequentemente retrair para longe do local da lesão. Os axônios poupados da lesão inicial pode depois sofrer degeneração axonal secundária. A falta de formação do cone de crescimento, regeneração, e a perda de projecções axonais mielinizadas adicionais no interior da medula espinal limita grandemente a recuperação neurológica após lesão. Para avaliar como centro de axônios mielinizados da medula espinhal responder a lesão, foi desenvolvido um modelo ex vivo vivendo medular utilizando camundongos transgênicos que expressam a proteína fluorescente amarela em axônios e um focal e altamente reprodutível induzida por laser lesão medular para documentar o destino de axônios e mielina (corante fluorescente lipofílico Nile Red) ao longo do tempo, através de microscopia de excitação de lapso de tempo de dois fótons. Processos dinâmicos como a lesão axonal aguda, retração axonal, e mielina degeneração são melhor estudadas em tempo real. No entanto, a natureza não-focal de lesões à base de contusão e artefatos de movimento encontradodurante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de alta resolução desafiador. O modelo ex vivo medula espinhal descrito aqui imita vários aspectos da contusão / induzida por compressão patologias axonal clinicamente relevantes, incluindo inchaço axonal, formação esferóide, transection axonal e peri-axonal inchaço fornecer um modelo útil para estudar esses processos dinâmicos em tempo real. As principais vantagens deste modelo são excelente resolução espaço-temporal que permite a diferenciação entre o insulto primário que fere diretamente os axônios e mecanismos de lesão secundária; perfusão controlada de reagentes directamente para o banho de perfusato o cabo; alterações precisas do meio ambiente (por exemplo, cálcio, íons de sódio, os contribuintes conhecidos lesão axonal, mas quase impossível de manipular in vivo); e modelos murinos também oferecem uma vantagem uma vez que proporcionam uma oportunidade de visualizar emanipular geneticamente populações celulares identificadas e estruturas subcelulares. Aqui, descrevemos como isolar e imagem da medula espinhal de ratos vivendo para capturar a dinâmica de lesão axonal aguda.

Introduction

A degeneração de axônios é uma causa importante de morbidade abrangendo várias condições neurológicas, incluindo neurotrauma, acidente vascular cerebral, auto-imune, e doenças neurodegenerativas. Ao contrário do sistema nervoso periférico (SNP), sistema nervoso central (SNC) axónios têm uma capacidade limitada para se regenerar uma vez feridas devido a ambas as barreiras intrínsecos e extrínsecos (isto é, moléculas inibidoras do crescimento axonal produzido durante a formação de cicatriz e libertado durante a degeneração da mielina) ^{1 -7.} Embora várias dessas barreiras foram amplamente exploradas, intervenções terapêuticas destinadas a prevenir a degeneração axonal CNS, promover a regeneração axonal robusta, e restaurar connectively funcional, permanecem limitados.

Axónios uma vez separados do soma passam por um processo de degeneração estereotipada conhecida como degeneração Wallerina que é caracterizado pela presença de edema axonal, formação esferóide fragmentação e eventual (revistos em ^8). Emcontraste, o coto proximal que permanece em continuidade com a soma de um axônio periférico seccionado, forma um inchaço no seu fim, morre de volta ao nó mais próximo de Ranvier, e pode, então, iniciar o crescimento do cone formação, um pré-requisito vital necessário para posterior regeneração axonal ^9-11. Em contraste, as terminações axonais proximais dos axónios muitas centrais formam característicos "endbulbs" ou lâmpadas de retracção, não conseguem formar cones de crescimento, e em vez retrair para longe do local da lesão, onde permanecem durante meses após a lesão ^12-15. Além da lesão axonal primária, axonal dano / perda adicional também pode ocorrer a axônios que foram em grande parte poupadas da lesão inicial. Esta perda axonal atrasado de axônios inicialmente poupado é referida à degeneração axonal como secundário. Esta resposta inerente de axônios do SNC a lesão torna a regeneração axonal funcional uma meta ainda mais difícil de conseguir no cérebro e na medula espinhal.

Embora hallmarks de lesão axonal (por exemplo, a formação de esferóide, lâmpadas de retração) foram bem caracterizados a partir de tecido post-mortem e modelos experimentais de degeneração axonal, elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a esses processos dinâmicos foi restringido. A maioria desses estudos se baseou em observações ponto final estático que, inerentemente, não conseguiu captar respostas axonal individuais ao longo do tempo. Embora exogenamente aplicado marcadores axonais ter sido útil para elucidar respostas axonal das seções estáticas e durante o exame ao vivo, a disponibilidade de marcadores axonais geneticamente codificados tem melhorado muito a nossa capacidade de visualizar os axônios em tempo real por meio de microscopia de fluorescência. De fato, um relatório seminal de Kerschensteiner e colegas fornecida primeira evidência direta de degeneração axonal e regeneração in vivo utilizando camundongos Thy1 -GFP-S que codificam a proteína verde fluorescente em subconjuntos de neurônios que enviam suas projeções nas colunas dorsais da medulacabo de ^16. Imagens ao vivo abordagens por microscopia de varredura a laser photon dois (TPLSM) e rotulagem proteína fluorescente genético das células de interesse continua a fornecer evidências diretas e visão mecanicista em muitas e diversas processos dinâmicos como a degeneração axonal, Ca ²⁺ sinalização, a regeneração axonal, fisiologia astrócitos, fisiologia microglial, e resposta à lesão ^17-25.

Em contraste com os axónios, muito pouco se sabe sobre as respostas à lesão da mielina em tempo real. A mielina é um componente vital da matéria branca produzido e mantido por oligodendrócitos nas células do SNC e de Schwann no PNS. Mielina protege 99% da superfície de axônios e fazendo assim fornece uma alta resistência, revestimento protector baixa capacitância que suporta propagação do impulso saltatory rápida e eficiente, recentemente revisado por Buttermore et al. ^26. Para capturar a resposta dinâmica da mielina a lesão usamos o solvatocrômico, lipofílicocorante fluorescente Vermelho de Nilo ^27. As propriedades solvatocrômicos deste corante vital permitir mudanças de espectro de seu espectro de emissão que é dependente do ambiente físico-química ^28,29. Estas propriedades são úteis para obter insights sobre os mecanismos de lesão axomyelinic e pode ser visualizada usando dichroics devidamente seleccionados, filtros de emissão ou resolvidos usando microscopia espectral ^27. Por exemplo, o espectro de emissão do vermelho do Nilo é azul-deslocada em ambientes ricos em lípidos menos polares, tais como aqueles encontrados nos adipócitos e mielina do SNC normal (pico de emissão ~ 580-590 nm) ^27. Em contraste, o espectro da emissão deste corante vital em ~ 625 nm em endbulbs formados como axônios passam por perecimento axonal ^27. Embora os mecanismos precisos subjacentes a estas mudanças de espectro especificamente em endbulbs contra mielina normais permanecem obscuros, tais mudanças espectrais pode revelar alterações subjacentes na acumulação de proteínas ou desorganização levando aexposição de sítios de ligação hidrofóbicos ^27.

Enquanto a imagem in vivo é a métrica final para observar medula espinhal dinâmica lesão axonal em seu ambiente nativo, é tecnicamente desafiador e requer perícia cirúrgica substancial, e muitas vezes repetir cirurgias para expor a coluna dorsal que pode introduzir artefatos experimentais (por exemplo, inflamação e cicatriz formação). Além disso, o equipamento caro é muitas vezes necessário para permitir que a suspensão e o posicionamento de um animal intacto sob a lente objectiva de microscópio. Os animais devem ser cuidadosamente monitorados, bem como para garantir que eles permaneçam quentes, para garantir fluidos são reabastecidos, e para garantir que não há sinais de hipóxia por sessões de imagem anestesiados prolongados. Este último é extremamente importante como axónios e mielina requerem absolutamente constante de perfusão e os níveis de oxigénio adequados para permanecerem viáveis. No entanto, isso muitas vezes não é relatado ou monitorados em mais estudos in vivo paradata. Além disso, os artefatos de movimento, devido à freqüência cardíaca e respiração (anestesia inalatória adulto mouse: ~ 300-450 batimentos por minuto (BPM) é ideal para manter a 97-98% de saturação de oxigênio (normal taxa de ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respirações por min (taxa normal é de ~ 163 respirações por minuto), respectivamente)) ³⁰ encontrados durante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de fluorescência alta resolução desafio, até mesmo as varreduras a laser mais rápidos inevitavelmente estão sujeitas a estes movimentos artefatos. Avanços na ultra-rápidos scanners de ressonância combinados com uma janela vertebral rígida implantável enquadrado pode permitir imaging da medula espinhal murino em animais acordados, mas os tempos mais rápidos de digitalização inevitavelmente reduzir a relação sinal-ruído qualidade de imagem degradante. Outras melhorias nas técnicas de imagem da medula espinhal como actualmente utilizados para exames de imagem cerebral pode superar muitos desses obstáculos e limitar os potenciais fatores de confusão introduzidas pela inaperfusão tecidual dequate, por exemplo, ^31-33.

Muito do que se sabe sobre a fisiologia da substância branca e mecanismos de lesão substância branca foi determinado utilizando in vitro ou ex vivo preparações de substância branca do nervo óptico, nervo periférico, e as tiras de medula espinhal substância branca ^34-41. Estas preparações continuar a aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de lesão da substância branca como eles permitem variações dos fatores ambientais, a aplicação controlada de medicamentos e reagentes, avaliações funcionais usando eletrofisiologia, e observações diretas microscopia de fluorescência dos axônios e mielina em tecidos vivos controlada. No entanto, algumas abordagens anteriores para observar axônios de cordão espinhal tiras de coluna dorsal ou tiras de substância branca ventral inevitavelmente ferir axônios de superfície durante a fase de remoção que pode influenciar a resposta dos axônios de perto opostos. Para capitalizar sobre as manipulações experimentais acima e evitar danos ao vefibras ry sob investigação, utilizamos um modelo da medula espinhal cervical ex vivo em que evita o contato direto do aspecto dorsal da medula. Assim, a arquitetura da pia-máter e axônios da coluna dorsal superficial adjacentes permanecem viáveis ​​e imperturbável durante o isolamento.

Aqui nós descrevemos uma abordagem relativamente simples, que permite a visualização direta de axônios mielinizados centrais como eles respondem dinamicamente a uma lesão focal em tempo real até 8 – 10+ horas após a lesão. A lesão medular modelo induzido por laser (Lisci) permite a diferenciação entre os mecanismos de lesão axonal primário e secundário como a lesão primária (local de ablação) permanece espacialmente restritos ao longo do tempo. A câmara de imagem-banho aberto é acessível a intervenção terapêutica, de fornecimento de reagentes, e manipulações ambientais. Agentes protetores axomyelinic putativos pode ser rapidamente avaliado em tempo real através de observações diretas contra experiências longas e custosas que envolvam processo tecidoing, seccionamento, immunostaining, captura de imagem, e análise e, portanto, fornece um modelo substituto útil para avaliar as respostas agudas e manipulações de proteção antes de testar os agentes experimentais em animais vivos.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso comitê animal Institucional da Universidade de Louisville, aderindo às regulamentações federais. 1. Preparação de Baixo Ca 2+ e 2 Ca 2+ mM líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) perfusatos Prepare 2x baixo Ca2 + (0,1 mM) da tampão C, 2x Ca 2+ normais (2 mM) da Um tampão, tampão e 2x da B como descrito na <str…

Representative Results

Detalhes de um laboratório adequado configurar necessário para isolar, manter a viabilidade, e da imagem do ex vivo medula espinhal é mostrado na Figura 1. O microscópio deve ser equipado com um laser ajustável pulsado femtosegundo, dicroics apropriados e filtros de emissão, e uma água mergulhando lente objetiva com uma alta abertura numérica (≥1.0). Para assegurar a viabilidade da medula espinhal durante a dissecção, o procedimento deve ser realizado na presença de Ca2 +</sup…

Discussion

Descreve-se um método de imagiologia ex vivo da medula espinal axónios mielinizados (isto é, fascículo gracile) combinada com uma lesão da medula espinal induzida por laser para estudar a progressão dinâmica de ambos degeneração axonal mielinizados primário e secundário ao longo do tempo. Ex vivo de imagens da superfície de da medula espinal supera muitas das complicações associadas com a imagem in vivo, tais como artefactos de movimento e o potencial de hipoxia…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin