Bir<em> Ex vivo</em> Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için
Summary
We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.
Abstract
Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.
Introduction
Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) 1 hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip -7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır.
Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve (8 gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir 9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik "endbulbs" veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma 12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü.
Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord 16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca 2 + sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma 17-25 yanıt.
Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. 26 tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı 27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına 28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak 27 çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) 27 bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına 27 uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin 27 maruz kalma.
In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) 30 bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, 31-33.
Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde 34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır.
Yaralanma sonrası 10+ saat – İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yüzey görüntüleme ex vivo olarak omurilik miyelinli aksonlar (yani, ince yapılı fasikül) zaman içinde hem birincil hem de ikincil miyelinli aksonal dejenerasyon dinamik ilerlemesini incelemek için bir lazer kaynaklı, omurilik yaralanması ile birleştirildi. Ex vivo görüntüleme için bir yöntem tarif Omurilik gibi hareket eserler ve uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında deneyci kaynaklı hipoksi potansiyeli olarak in vivo görüntüleme ile ilişkili kom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration ‘dieback’ in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
