<em> Ex Vivo</em> חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

אקסונים CNS נפצעו מצליחים להתחדש ולעתים קרובות לחזור ממקום הפציעה. האקסונים חסכו מהפגיעה הראשונית עשויים מאוחר יותר לעבור ניוון axonal המשני. חוסר היווצרות חרוט צמיחה, התחדשות, ואובדן של תחזיות axonal myelinated נוספות בחוט השדרה מאוד מגביל התאוששות נוירולוגית בעקבות פציעה. כדי להעריך איך מרכזי האקסונים myelinated של חוט השדרה מגיבים לפציעה, שפיתחנו vivo לשעבר המתגורר מודל חוט השדרה ניצול עכברים הטרנסגניים המבטאים חלבון צהוב ניאון באקסונים ומוקדים ופגיעה בחוט השדרה נגרם-לייזר לשחזור מאוד לתעד את גורלם של האקסונים והמיאלין (צבע ניאון lipophilic הנילוס אדום) לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות עירור שני פוטונים. תהליכים דינמיים כגון פגיעה חריפה axonal, הכחשה axonal, וניוון המיאלין נלמדים הטובים ביותר בזמן אמת. עם זאת, האופי הלא-המוקד של פציעות המבוססת על חבלה וחפצי תנועה נתקל בבמהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מאתגר. לשעבר מודל חוט השדרה vivo המתואר כאן מחקה כמה היבטים של חבלה / פתולוגיות axonal מושרה דחיסה רלוונטיות קליני כוללים נפיחות axonal, היווצרות אליפטית, חיתוך רוחב axonal, ופרי-axonal נפיחות מתן מודל שימושי ללמוד תהליכים הדינמיים אלה בזמן אמת. יתרונות עיקריים של מודל זה הם ברזולוציה spatiotemporal מצוינת המאפשרת הבחנה בין העלבון העיקרי שפוגע ישירות אקסונים ומנגנוני פציעה משניים; עירוי מבוקר של חומרים כימיים ישירות לרחצת perfusate הכבל; שינויים מדויקים של הסביבה הסביבתית (למשל, סידן, יוני נתרן, תורמים ידועים לפציעת axonal, אבל כמעט בלתי אפשרית לתפעל in vivo); ומודלים עכבריים מציעים גם יתרון כפי שהם מספקים הזדמנות לחזות ולתפעל אוכלוסיות תאים מזוהות מבחינה גנטית ומבני subcellular. כאן אנו מתארים כיצד לבודד ותמונת חוט השדרה חי מעכברים כדי ללכוד דינמיקה של פגיעת axonal חריפה.

Introduction

ניוון של אקסונים הוא סיבה בולטת של תחלואה פורש כמה תנאי נוירולוגיות כוללים neurotrauma, שבץ, אוטו-אימוניות, ומחלות ניווניות. בניגוד למערכת העצבים ההיקפי (PNS), מערכת עצבים מרכזית יש אקסונים (CNS) קיבולת מוגבלת להתחדש נפצע פעם הן בשל חסמים פנימיים וחיצוניים (כלומר, מולקולות מעכבות לצמיחת axonal הופקה במהלך היווצרות צלקת ושחררה במהלך ניוון המיאלין) ^{1 -7.} למרות שכמה ממחסומים אלה נחקרו בהרחבה, התערבויות טיפוליות שמטרתה למנוע ניוון axonal CNS, לקדם התחדשות axonal חזקה, ולשחזר connectively הפונקציונלי, תישאר מוגבל.

האקסונים מופרדים מפעם אחת סומה לעבור תהליך של הניוון סטריאוטיפי הידוע כניוון Wallerian המתאפיין בנפיחות axonal, היווצרות אליפטית ופיצול סופו של דבר (שנסקר ^ב8). בלעומת זאת, הגדם הפרוקסימלי שנותר ברציפות עם סומה של האקסון היקפי transected, יוצר נפיחות בקצה שלה, מת חזרה לצומת הקרובה ביותר ל Ranvier, ולאחר מכן יכול ליזום היווצרות חרוט צמיחה, תנאי חיוני נחוץ להתחדשות axonal הבאה ^9-11. בניגוד לכך, הסופים axonal הפרוקסימלי של אקסונים רבים מרכזיים יוצרים "endbulbs" אופייני או נורות הכחשה, לא מצליחים ליצור קונוסים צמיחה, ובמקום לחזור ממקום הפציעה שם הם נמצאים במשך חודשים לאחר פציעת ^12-15. בנוסף לפציעת axonal העיקרית, נזק / הפסד axonal נוסף עלול להתרחש גם לאקסונים שנחסכו במידה רבה מהפגיעה הראשונית. אובדן axonal עיכוב זה של אקסונים בתחילה חסכו מכונה ניוון axonal המשני כ. תגובה טבעית זו של האקסונים במערכת העצבים המרכזית לפגיעה הופכת התחדשות axonal תפקודית קשה עוד יותר להשיג את המטרה במוח ובחוט השדרה.

למרות חהllmarks פציעה axonal (למשל, היווצרות אליפטית, נורות הכחשה) מתאפיינת גם מרקמות שלאחר המוות ומודלים ניסיוניים של ניוון axonal, הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים הדינמיים אלה הוגבלה. רוב המחקרים האלה הסתמכו על תצפיות נקודת סיום סטטי שמטבעם לא הצליחו ללכוד תגובות axonal בודדות לאורך זמן. למרות אקסוגני מיושם קליעים נותבים axonal היו מועילים להבהיר תגובות axonal מסעיפי סטטי ובמהלך ההדמיה חיה, את הזמינות של סמני axonal מקודד גנטי השתפרה מאוד את היכולת שלנו לדמיין האקסונים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ואכן, דו"ח זרע מKerschensteiner והעמיתים סיפק ראיות ישירות של ניוון והתחדשות axonal הראשון in vivo באמצעות עכברי Thy1 -GFP-S שמקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתת קבוצות של תאי עצב ששולחים תחזיות שלהם בעמודות הגב של עמוד השדרהכבל ^16. הדמיה חיה גישות באמצעות שתי מיקרוסקופיה פוטון סריקת לייזר (TPLSM) וסימון חלבון פלואורסצנטי הגנטי של תאי העניין ממשיך לספק ראיות ישירות ותובנה מכניסטית לרבים תהליכים דינמיים מגוונים כגון ניוון axonal, Ca ^{2 +} איתות, התחדשות axonal, פיזיולוגיה astrocyte, פיזיולוגיה microglial, ותגובה לפציעה ^17-25.

בניגוד לאקסונים, מעט מאוד ידוע של תגובות מיאלין לפציעה בזמן אמת. מיאלין הוא רכיב חיוני של חומר לבן המופק ומתוחזק על ידי oligodendrocytes בתאי מערכת העצבים המרכזית ושוואן בPNS. המיאלין מבודד 99% מהשטח של אקסונים ועל ידי כך מספק גבוהה התנגדות, כיסוי מגן נמוך קיבול התומך בהתפשטות מהירה ויעילה קופצנית דחף, נבדקה לאחרונה על ידי Buttermore et al. ^26. כדי ללכוד את התגובה הדינמית של מיאלין לפציעתם אנו משתמשים solvatochromic, lipophilicצבע פלואורסצנטי הנילוס אדום ^27. מאפייני solvatochromic של כתם חיוני זה מאפשרים משמרות רפאים של ספקטרום הפליטה שלה, כי הוא תלוי בסביבה הפיסיקלית הכימית ^28,29. מאפיינים אלה הם שימושיים כדי לקבל תובנה מנגנונים של פגיעת axomyelinic וניתן דמיינו באמצעות dichroics כראוי נבחר ומסנני פליטה או נפתרו באמצעות מיקרוסקופ רפאים ^27. לדוגמא, ספקטרום הפליטה של הנילוס האדום הוא בסביבות פחות קוטביות, שומנים בדם עשיר כמו אלה שנמצאו בתאי שומן והמיאלין במערכת העצבים המרכזית נורמלי (פליטת שיא ~ 580-590 ננומטר) ²⁷ העבירו כחול. בניגוד לכך, פסגות ספקטרום פליטה של צבע חיוני זה ב ~ 625 nm בendbulbs נוצר כהאקסונים עוברות dieback axonal ^27. למרות שהמנגנון המדויק שבסיס משמרות הרפאים האלה במיוחד בendbulbs לעומת המיאלין נורמלי עדיין אינו ברור, שינויי רפאים כזה עשויים לחשוף שינויים הבסיסיים בהצטברות חלבון או חוסר ארגון מוביל לחשיפה של אתרי קישור הידרופובי ^27.

בעוד ההדמיה in vivo הוא המדד האולטימטיבי להתבוננות דינמיקת פציעת axonal חוט השדרה בסביבה הטבעית שלהם, זה מאתגר מבחינה טכנית ודורש מומחיות כירורגית משמעותית, ולעתים קרובות חוזרים ניתוחים לחשוף את העמודה הגבית שעשויה להציג את ממצאי ניסוי (למשל, דלקת וצלקת היווצרות). בנוסף, ציוד יקר יש צורך לעתים קרובות כדי לאפשר השעיה ומיצוב של בעלי חיים שלמים תחת העדשה האובייקטיבית מיקרוסקופ. בעלי החיים צריכים להיות במעקב צמוד וכן כדי להבטיח שהם יישארו חמים, כדי להבטיח נוזלים מתחדשות, ועל מנת להבטיח אין סימנים של חוסר חמצן בגלל ממושכת פגישות הדמיה בהרדמה. האחרון הוא חשוב מאוד כאקסונים והמיאלין בהחלט דורשים זלוף קבוע ורמות חמצן נאותות להישאר בת קיימא. עם זאת, זו היא לעתים קרובות לא דווחה או במעקב ברוב במחקרי vivo לתאריך. בנוסף, חפצי תנועה בשל קצב לב ונשימה (isoflurane מורדמים עכבר מבוגר: ~ 300-450 פעימות לדקה (BPM) היא אופטימליות כדי לשמור על 97-98% רוויון חמצן (שיעור ~ 632 BPM הרגיל) ו~ 55-65 נשימות לדקה (קצב נורמלי הוא ~ 163 נשימות לדקה), בהתאמה)) ³⁰ נתקלו במהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה מאתגרים כמו גם סריקות הלייזר המהירות ביותר באופן בלתי נמנע כפופים לתנועה הבאות חפצים. התקדמות בסורקי התהודה ultrafast בשילוב עם חלון השדרה נוקשה מושתל ממוסגר עשויים לאפשר הדמיה של עמוד השדרה העכברית בבעלי חיים ער, אבל פעמים סריקה מהירה יותר באופן בלתי נמנע להפחית את האות לאיכות תמונה משפילה יחס רעש. שיפורים נוספים בטכניקות הדמיה חוט השדרה הכמשמשים כיום להדמיה מוחית יכולים להתגבר על מכשולים רבים של אלה ולהגביל את הבלבול פוטנציאלי שהוצג על ידי inaזלוף הרקמה dequate, למשל, ^31-33.

הרבה ממה שידוע על פיזיולוגיה חומר לבנה ומנגנונים של פגיעה בחומר לבנה כבר נקבע באמצעות במבחנה או תכשירי vivo לשעבר של חומר לבן מעצב ראייה, עצבים היקפיים, ורצועות של חומר לבן בחוט השדרה ^34-41. הכנות אלה ימשיכו לקדם את הידע של מנגנוני פציעה בחומר לבנים שלנו מאחר שהם מאפשרים מבוקרים שינויים בגורמים סביבתיים, יישום מבוקר של תרופות וחומרים כימיים, הערכות תפקודיות באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ותצפיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות של אקסונים והמיאלין ברקמה חי. ובכל זאת, כמה גישות קודמות להתבונן האקסונים מרצועות עמודה הגבי חוט השדרה או רצועות חומר לבנים הגחון בלתי נמנע לפגוע האקסונים פני השטח במהלך שלב הסילוק שעשוי להשפיע על התגובה של אקסונים התנגדו באופן הדוק. כדי לנצל את מניפולציות ניסוי לעיל ולמנוע נזק לveסיבי ר"י תחת חקירה, אנו משתמשים במודל כבל vivo לשעבר צוואר רחם השדרה כפי שהוא מונע מגע ישיר של ההיבט הגבי של החוט. לפיכך, את הארכיטקטורה של מאטר פיא ואקסונים טור גב שטחי סמוכים להישאר קיימא ומוטרד בבידוד.

כאן אנו מתארים גישה פשוטה יחסית, המאפשרת הדמיה ישירה של אקסונים myelinated המרכזיים כפי שהם באופן דינמי להגיב לפציעת מוקד בזמן אמת עד 8 – 10 + שעות לאחר פציעה. פגיעה בחוט השדרה המודל מושרה הלייזר (LiSCI) מאפשר הבחנה בין מנגנונים הראשוניים ומשניים פציעת axonal כנגע הראשוני (אתר אבלציה) נותר מוגבלים במרחב לאורך זמן. חדר ההדמיה פתוחה האמבטיה נגיש להתערבות טיפולית, משלוח מגיב, ומניפולציות סביבתיות. סוכני מגן axomyelinic משוערים ניתן להעריך במהירות בזמן אמת על ידי תצפיות ישירות לעומת ניסויים ממושכים ויקרים הכרוכים בתהליך הרקמהing, חתך, immunostaining, לכידת תמונה, וניתוח, ולכן מספק מודל פונדקאית שימושי כדי להעריך את תגובות חריפות ומניפולציות מגן לפני בדיקת הסוכנים הניסיוניים בבעלי חיים.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לואיוויל, הקפדה על תקנות הפדרליות. 1. הכנת נמוכה Ca 2 + 2 מ"מ וCa 2 + מלאכותי נוזל השדרתי (aCSF…

Representative Results

פרטים של מעבדה מתאימה להגדיר צורך לבודד, לשמור על כדאיות, ותמונה בעמוד השדרה vivo לשעבר מוצגים באיור 1. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד בליזר מתכונן פעם femtosecond, dicroics המתאים ומסנני פליטה, ומים טבילת עדשה אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה (≥1.0). כדי להבטיח יכולת קיום …

Discussion

אנו מתארים שיטה של הדמיה לשעבר ההדמיה vivo האקסונים myelinated חוט השדרה (כלומר, fasciculus החינני) בשילוב עם פגיעה בחוט השדרה מושרה לייזר ללמוד את ההתקדמות הדינמית של שני ניוון axonal myelinated הראשוני והמשני לאורך זמן. Ex vivo של פני השטח של חוט השדרה מתגבר רב של הסיבו?…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin