A Simple Kritische-sized Femorale Defect Model in Muizen

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Geschat wordt dat de helft van de Amerikaanse bevolking ervaart een fractuur door de leeftijd van 65 ^1. Voor die patiënten met fracturen behandeld chirurgisch, 500.000 procedures gepaard met het gebruik van een bottransplantatie ² en dit aantal zal naar verwachting stijgen met de toenemende vergrijzing ³ . Hoewel bot is een van de weinige organen die het vermogen volledig genezen zonder littekens heeft, zijn er gevallen waarin het mislukt ^3,4. Afhankelijk van de omstandigheden en de kwaliteit van de behandeling, 2-30% van de lange botbreuken mislukken, wat resulteert in niet-union ^3,5. Hoewel er enige discussie over de definitie, pseudoartrose, kritisch-sized of non-union verwondingen bot blijft over het algemeen verwijst naar een blessure die niet geneest over de natuurlijke levensduur van het onderwerp ^6. Voor experimentele doeleinden wordt de looptijd verkort tot de gemiddelde tijd vereist voor volledige genezing van een middelgroot botletsel. Non-union botlaesies optreden voor numerous redenen, maar de belangrijkste factoren zijn onder extreme trauma resulteert in een kritisch-sized gat, infectie, slechte angiogenese, het gebruik van tabak, of geremd osteoregenerative capaciteit als gevolg van ziekte of leeftijd ^7. Hoewel non-unions succesvol behandeld kan kosten dan $ 60.000 per procedure, afhankelijk van het type van verwonding en de benaderingen toegepast ^8.

In matige gevallen wordt autologe bottransplantatie tewerkgesteld. Deze strategie omvat herstel van bot van een donor plaats en implantatie op de plaats van verwonding. Deze aanpak is bijzonder effectief, de hoeveelheid beschikbare donor afgeleide bot is beperkt en de procedure omvat een nieuwe ingreep, waardoor aanhoudende pijn bij veel patiënten ^9,10. Bovendien is de effectiviteit van de autoloog bottransplantaat is afhankelijk van de gezondheid van de patiënt. Botsubstituten gemaakt van synthetische materialen of verwerkt cadaveric bot zijn overvloedig beschikbaar ^11-13, maar ze have belangrijke beperkingen, met inbegrip van slechte gastheer-cel adhesie eigenschappen, verminderd osteoconductiviteit, en de kans op afstoting ^14. Er is dan ook dringend behoefte aan regeneratie van bot technologieën die veilig, effectief en op grote schaal beschikbaar zijn.

Ons vermogen om bot regeneratieve strategieën verbeteren kritisch afhankelijk van het vermogen om serieuze bot trauma nabootsen proefdieren, maar de vorming en stabilisatie van grote botletsels is technisch uitdagend. In de meeste gevallen wordt ernstig lange bot trauma experimenteel nagebootst door de oprichting van een defect dat van nature niet zal genezen. Hoewel het kan variëren met soorten ^15, dit wordt bereikt door volledige verwijdering van een bot segment die groter is dan 1,5 maal de diameter van het bot doorsnede ^16. Het bot wordt vervolgens gestabiliseerd met een metalen implantaat juiste oriëntatie van de breuk randen bewaren en de mobiliteit. Door hun kleine formaat en de kwetsbaarheid vanhun lange botten, oprichting van dergelijke letsels bij muizen zijn dan de mogelijkheden van de meeste onderzoeksgroepen. Als zodanig zijn lange botdefecten modellen beperkt tot ratten en grotere dieren. Toch muizen veroorloven belangrijk onderzoek voordelen in dat ze genetisch kunnen worden gemodificeerd en gefokt als immuun-gecompromitteerde stammen die geen menselijke cellen en weefsels niet in geloven.

Voor menselijke cel-gebaseerde applicaties, immuun-gecompromitteerde muizen zijn aantrekkelijk om mee te werken, omdat ze fysiologisch goed gekarakteriseerd, gemakkelijk te huis, kosteneffectief en eenvoudig geanalyseerd radiologisch en histologisch. Van groot belang is dat immuun-gecompromitteerde muizen geen cellen van verschillende soorten, waaronder de mens wijzen. Hun kleine formaat maakt ook het testen van zeer kleine aantallen cellen of volumes van experimentele steigers in orthopedische toepassingen. Verscheidene muizen orthopedische modellen gemeld dat verschillende mate been stabiliteit ^17,18 veroorloven. Die systems die resulteren in zeer hoge stabiliteit, zoals externe fixators en sluitplaten voornamelijk genezend intramembraneuze ossificatie hoewel endochondrale genezing is gemeld ^19. Daarentegen, die een aantal micro- en / of macro-beweging, zoals gebruik losgemaakt of gedeeltelijk vaste medullaire kunnen toestaan ​​algemeen genezen met een overwicht van endochondrale ossificatie ^20,21. Vertraagd unie of non-union defecten van lange botten zijn bijzonder moeilijk te bereiken bij muizen te wijten aan de extra niveau van stabilisatie nodig. Echter, een aantal benaderingen waargenomen, inclusief medullaire kunnen met elkaar verbindende spijkers, sluitplaten en externe fixators ^22. Deze systemen over het algemeen goed te werken, maar gezien hun ingewikkelde ontwerp kunnen ze technisch uitdagend te installeren zijn. Bijvoorbeeld, Garcia et al. ²³ bedacht elegante interlocking pin voor gebruik in muizen, maar de procedure omvat incisies op twee aparte sites en uitgebreide modificatie van de femur de pennen passen. Deze procedures werden uitgevoerd onder een dissectie microscoop.

Hierin beschrijven we een eenvoudige femorale medullaire pen met een centrale kraag ontworpen om sluiting van een 3 mm tekort bot voorkomen en ook toespitsen op het oorspronkelijke randen van het defect. Terwijl de pen is niet bevestigd aan het bot zelf, nauwkeurige dimensionering van de pendiameter en ruimen van de mergholte resultaten voldoende interferentie torsie- beweging (figuur 1) te verminderen. Met een zorgvuldige selectie van ingeteelde leeftijd, geslacht en stam afgestemd muizen, het resultaat is een zeer reproduceerbare hypertrofische niet- uniondefect ²² die gemakkelijk radiologisch kunnen worden geëvalueerd. Bovendien gebieden die van belang kan reproduceerbaar worden bepaald na micro-computertomografie (μCT) voor het meten van de novo botvorming en histomorfologische parameters. De pennen werden prototyped in ons laboratorium met behulp van gemakkelijk beschikbare hulpmiddelen.

Figuur 1: Experimentele principe Schematische samenvatting van het segmentaal defect model.. De centrale 3 mm segment van 9-10 mm muis femur chirurgisch uitgesneden (links). Een 3 mm lang, 19 gauge chirurgisch stalen buis wordt over een 9 mm lang, 22 G roestvrijstalen buis Gelijmde precies in het midden (rechts). De resulterende pen wordt aangebracht in de medullaire kanalen van de resterende proximale en distale delen van het femur met 19 G kraag vervangen van 3 mm segment been (hierna, midden).

Protocol

LET OP: Dit protocol is bedoeld voor vrouwelijk naakt (Nu / J) muizen (18-25 g, 6 weken) overgenomen van Jackson Laboratories. Sinds stammen van muizen enigszins variëren in termen van de anatomie en de groeisnelheid, adviseren wij dat de fabricage van de pinnen is geoptimaliseerd om de stam, geslacht en leeftijd van de ontvangers voorafgaand aan implantatie in live-onderwerpen. Als de stammen zorgvuldig zijn afgestemd, de passing tussen de pen en de mergholte is zeer reproduceerbaar. Procedures voor huisvesting, voedi…

Representative Results

Muizen meestal herstellen bewustzijn en achterbenen ledematen mobiliteit 5-10 minuten na de terugtrekking van de anesthesie. Gedurende de eerste 5 dagen, is het raadzaam om muizen afzonderlijk huis en voeren milieu verrijking overmatig gebruik van de ledemaat voorkomen. Voor dit doel, iglo-type nesten verminderen de noodzaak voor nestbouw en rusten te moedigen. We hebben ook waargenomen dat levering van voedsel en hydrogel op de vloer van de kooi vermindert de kans op pin verplaatsing. Gedurende de periode van 5 dagen, …

Discussion

Hierin is een eenvoudige methode beschrijven we een kritisch-sized-pins gestabiliseerd defect van het muizen femur met standaard laboratorium en veterinaire apparatuur genereren. Terwijl de assemblage van de pennen en de chirurgische procedure zelf vereist oefening, het is ruim binnen de mogelijkheden van een goed opgeleide biomedisch onderzoek wetenschapper of dierenarts.

De pen wordt geplaatst in het medullaire kanaal zonder extra fixatie, waardoor de procedure technisch haalbaar dan ingew…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.