Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Si stima che la metà della popolazione degli Stati Uniti sperimentare una frattura all'età di 65 ^1. Per i pazienti con fratture trattate chirurgicamente, 500.000 procedure comportano l'uso di un innesto osseo ² e questo numero è destinato ad aumentare con una popolazione sempre più anziana ³ . Sebbene osso è uno dei pochi organi che ha la capacità di guarire completamente senza cicatrici, ci sono casi in cui il processo non riesce ^3,4. A seconda delle circostanze e la qualità del trattamento, 2-30% delle fratture delle ossa lunghe fallire, con conseguente non-union ^3,5. Mentre rimane qualche dibattito sulla definizione, pseudoartrosi, lesioni ossee critici-size o non sindacalizzati in genere si riferisce a un infortunio che non guarisce tutta la durata naturale del soggetto ^6. Ai fini sperimentali, tale durata è ridotta al tempo medio necessario per la completa guarigione di una ferita di medie dimensioni delle ossa. Lesioni ossee non sindacali si verificano per nummotivi erous, ma i principali fattori includono traumi estremi conseguente gap critico dimensioni, infezione, povero angiogenesi, uso di tabacco, o la capacità osteoregenerative inibito a causa di malattie o ⁷ anni. Anche se non unioni sono trattati con successo, può costare oltre $ 60.000 al procedimento, a seconda del tipo di lesione e gli approcci impiegati ^8.

In casi moderati, innesto osseo autologo è impiegato. Questa strategia comporta il recupero di osso da un sito donatore e l'impianto nel sito di lesione. Mentre questo approccio è estremamente efficace, il volume di osso disponibile donatore-derivato è limitata e la procedura prevede un ulteriore intervento chirurgico, che si traduce in dolore persistente in molti pazienti ^9,10. Inoltre, l'efficacia dell'innesto osseo autologo dipende della salute del paziente. Sostituti ossei in materiali sintetici o di osso da cadavere elaborati sono disponibili in abbondanza ^11-13, ma HAve significative limitazioni, tra cui scarse proprietà di adesione della cellula ospite, ridotto osteoconduttività, e la possibilità di rigetto immunitario ^14. Vi è quindi un urgente bisogno di tecnologie di rigenerazione ossea che sono sicuri, efficaci e ampiamente disponibile.

La nostra capacità di migliorare le strategie di rigenerazione dell'osso è criticamente dipendente dalla capacità di imitare gravi traumi ossei in animali da laboratorio, ma la generazione e la stabilizzazione di grandi lesioni ossee è tecnicamente impegnativo. Nella maggior parte dei casi, gravi traumi delle ossa lunghe è imitato sperimentalmente stabilendo un difetto che non guarire naturalmente. Anche se può variare con specie ^15, questo si ottiene la rimozione completa di un segmento osseo che è maggiore di 1,5 volte il diametro dell'osso sezione ^16. L'osso viene poi stabilizzato con un impianto metallico per mantenere il corretto orientamento dei bordi di frattura e consentire la mobilità. A causa della loro piccola dimensione e la fragilitàle ossa lunghe, la creazione di tali lesioni nei topi sono oltre le capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. Come tale, i modelli difettosi delle ossa lunghe sono limitati a ratti e animali più grandi. Tuttavia, i topi offrono notevoli vantaggi di ricerca in quanto possono essere geneticamente modificati e allevati come ceppi immunocompromessi che non rifiutano le cellule e tessuti umani.

Per le applicazioni basate sulle cellule umane, i topi immunocompromessi sono attraenti per lavorare con perché sono fisiologicamente ben caratterizzati, facile da casa, redditizio, e facilmente analizzati radiologicamente e istologicamente. Di fondamentale importanza è che i topi immunocompromessi non rifiutano le cellule di specie diverse, tra cui l'uomo. Le loro piccole dimensioni permette anche la sperimentazione di un numero esiguo di cellule o volumi di ponteggi sperimentali in applicazioni ortopediche. Diversi modelli murini ortopedici sono stati segnalati che offrono vari gradi di stabilità ossea ^17,18. Quelli systems che si traducono in livelli molto elevati di stabilità, come fissatori esterni e piastre di bloccaggio prevalentemente guarire da ossificazione intramembranosa anche se la guarigione endochondral è stato segnalato ^19. Al contrario, quelli che permettono alcune micro e / o macro-motion, come quelle che impiegano i perni midollari non fissati o parzialmente fissi, in genere guariscono con una predominanza di encondrale ^20,21. Unione ritardata o difetti non sindacali di ossa lunghe sono particolarmente difficili da realizzare nei topi a causa del livello extra di stabilizzazione necessaria. Tuttavia, una serie di approcci sono stati segnalati, tra cui i perni midollari con chiodi ad incastro, piastre di bloccaggio e fissatori esterni ^22. Questi sistemi generalmente funzionano bene, ma data la loro progettazione complicata possono essere tecnicamente difficile da installare. Ad esempio, Garcia et al. ²³ escogitato un elegante sistema pin incastro per l'uso nei topi, ma la procedura prevede due incisioni a sito separatos ed una sostanziale modifica del femore per accogliere i perni. Queste procedure sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione.

Qui, descriviamo un semplice perno midollare femorale con un collare centrale progettata per impedire la chiusura di un deficit ossea 3 mm e anche delineare i bordi originali del difetto. Mentre il perno non è stato fissato all'osso stesso, accurato dimensionamento del diametro del perno e alesatura dei risultati cavità midollare in interferenza sufficiente a minimizzare il movimento torsionale (Figura 1). Con un'attenta selezione di età inbred, genere e topi ceppo corrispondenza, il risultato è un altamente riproducibile ipertrofica non uniondefect ²² che può essere facilmente valutata radiologicamente. Inoltre le regioni di interesse possono essere definite in modo riproducibile dopo micro-tomografia computerizzata (μCT) per la misura di de novo formazione ossea e parametri istomorfologici. I perni sono stati prototipati nel nostro laboratorio utilizzando strumenti facilmente reperibili.

Figura 1: principio sperimentale sintesi schematica del modello di difetto segmentale.. Il segmento centrale 3 mm un femore murino 9-10 mm viene asportato chirurgicamente (a sinistra). A, 19 calibro tubo di acciaio chirurgico, lunga 3 mm, è passata sopra a 9 mm di lunghezza, 22 G tubo di acciaio inox e fissato con adesivo al centro esatto (a destra). Il perno risultante è montato nei canali midollari dei restanti porzioni prossimali e distali del femore con il collare 19 G sostituzione del segmento 3 mm dell'osso (di seguito, al centro).

Protocol

NOTA: Questo protocollo è progettato per nude (Nu / J) femmine di topo (18-25 g, 6 settimane) acquisito da Jackson Laboratories. Dal momento che i ceppi di topi variano leggermente in termini di anatomia e il tasso di crescita, si consiglia che la fabbricazione dei pin è ottimizzato per il ceppo, il sesso e l'età dei destinatari prima dell'impianto in soggetti vivi. Se i ceppi sono accuratamente abbinati, l'accoppiamento ad interferenza tra il perno e osseo cavità è altamente riproducibile. Procedure pe…

Representative Results

Mice tipicamente recuperare coscienza e arti posteriori mobilità 5-10 minuti dopo la sospensione di anestesia. Durante i primi 5 giorni, è consigliabile ospitare topi singolarmente e introdurre arricchimento ambientale per impedire l'utilizzo eccesso dell'arto. A questo scopo, igloo di tipo nidi riducono la necessità di costruzione del nido e incoraggiare riposo. Abbiamo anche osservato che la fornitura di cibo e idrogel sul pavimento della gabbia riduce la probabilità di dislocamento pin. Durante il periodo…

Discussion

Qui, si descrive un metodo semplice per generare un difetto critico-sized pin-stabilizzato del femore murino utilizzando standard di laboratorio e veterinari. Mentre l'assemblea dei perni e la procedura chirurgica in sé richiede pratica, è bene alla portata di un ricercatore biomedico ben addestrato o veterinario.

Il perno è posizionato nel canale midollare senza fissazione aggiuntiva, rendendo il procedimento tecnicamente più fattibile rispetto agli approcci più complicati che impi…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.