بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

ويقدر أن نصف سكان الولايات المتحدة يعاني من كسر في سن 65 ^1. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من كسور المعالجة جراحيا، تشمل 500،000 إجراءات استخدام الكسب غير المشروع العظام ² و من المتوقع أن يرتفع مع شيخوخة السكان على نحو متزايد ³ هذا العدد . على الرغم من أن العظام هي واحدة من عدد قليل من الأجهزة التي لديها القدرة على شفاء تماما بدون تندب، هناك حالات حيث فشل عملية ^3،4. تبعا للظروف ونوعية العلاج، 2-30٪ من كسور العظام الطويلة تفشل، مما أدى إلى عدم النقابات ^3،5. في حين لا يزال هناك بعض الجدل حول تعريف، فصال كاذب، وإصابات حرجة الحجم أو غير نقابية العظام تشير بصفة عامة إلى إصابة لا يلتئم على مدى عمر الطبيعي لهذا الموضوع ^(6). لأغراض تجريبية، هو تقصير هذه المدة إلى متوسط ​​الوقت اللازم للشفاء التام من متوسط ​​الحجم إصابة العظام. تحدث الآفات العظام غير نقابية لالأسطواناتأسباب erous، ولكن العوامل الرئيسية وتشمل الصدمة الشديدة مما أدى إلى وجود فجوة خطيرة الحجم، والعدوى، وضعف الأوعية الدموية، واستخدام التبغ، أو قدرة osteoregenerative تحول دون ذلك بسبب المرض أو العمر ^7. حتى لو يتم التعامل غير النقابات بنجاح، فإنه يمكن أن تكلف ما يزيد على 60،000 دولار في الإجراء، وهذا يتوقف على نوع الإصابة والمناهج المستخدمة ^8.

وفي الحالات المعتدلة، وتوظيف ذاتي ترقيع العظام. وتتضمن هذه الاستراتيجية استرداد العظام من موقع المانحة وغرس في موقع الإصابة. في حين أن هذا النهج هو فعالة للغاية، وحجم متاح العظام المستمدة المانحة محدود وينطوي على إجراء عملية جراحية إضافية، مما يؤدي إلى ألم مستمر في العديد من المرضى ^9،10. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فعالية من الكسب غير المشروع العظام ذاتي يعتمد على صحة المريض. هي بدائل العظام مصنوعة من مواد تركيبية أو معالجتها العظام جثي متوافرة بكثرة ^11-13، لكنها هكتارلقد قيود كبيرة، بما في ذلك سوء خصائص التصاق الخلية المضيفة، وانخفاض osteoconductivity، وإمكانية الرفض المناعي ^14. ولذلك هناك حاجة ملحة لتقنيات تجديد العظام التي هي آمنة وفعالة ومتاحة على نطاق واسع.

لدينا القدرة على تحسين استراتيجيات التجدد العظام تعتمد بشكل كبير على القدرة على تقليد الصدمة العظام خطيرة في حيوانات التجارب، ولكن الجيل واستقرار الآفات العظام كبيرة يمثل تحديا تقنيا. في معظم الحالات، يتم تحاكي صدمة خطيرة العظام الطويلة تجريبيا من خلال إنشاء الخلل التي لن تلتئم بشكل طبيعي. على الرغم من أنه يمكن أن تختلف مع الأنواع ^15، ويتحقق ذلك عن طريق الإزالة الكاملة للشريحة العظام أكبر من 1.5 مرة من قطر العظام المقطع العرضي ^16. ثم يستقر العظام مع زرع المعادن للحفاظ على التوجه السليم من حواف كسر والسماح للتنقل. نظرا لصغر حجمها وهشاشةالعظام الطويلة، وإنشاء مثل هذه الآفات في الفئران هم أبعد من قدرات معظم المجموعات البحثية. على هذا النحو، تقتصر نماذج عيب العظام الطويلة للفئران والحيوانات الكبيرة. ومع ذلك، والفئران تحمل مزايا البحثية الهامة في أنها يمكن المعدلة وراثيا وتربيتها كما سلالات خطر المناعية التي لا نرفض الخلايا البشرية والأنسجة.

لالتطبيقات المستندة إلى خلية الإنسان والفئران خطر المناعية جذابة للعمل مع لأنها من الناحية الفسيولوجية تتميز بشكل جيد، وسهلة المنزل، وفعالة من حيث التكلفة، وسهولة تحليلها شعاعيا وتشريحيا. من الأهمية بمكان أن الفئران خطر المناعية لا يرفض الخلايا من مختلف الأنواع بما في ذلك البشر. يسمح صغر حجمها أيضا اختبار أعداد صغيرة جدا من الخلايا أو مجلدات من السقالات التجريبية في تطبيقات العظام. تم الإبلاغ عن عدة نماذج تقويم العظام الفئران التي تحمل درجات مختلفة من الاستقرار العظام ^17،18. تلك التنفسيمللي التي تؤدي إلى مستويات عالية جدا من الاستقرار، مثل المثبتات الخارجية وتأمين لوحات تلتئم في الغالب من قبل التحجر داخل الغشاء على الرغم من أن الشفاء غضروفي وقد تم الإبلاغ عن ^19. في المقابل، تلك التي تسمح بعض المتناهية الصغر و / أو الحركة الماكرو، مثل تلك التي تستخدم المسامير النخاعية غير المثبتة أو جزئيا ثابتة، وشفاء بشكل عام مع غلبة التحجر غضروفي ^20،21. اتحاد تأخر أو عيوب غير نقابية من العظام الطويلة من الصعب بشكل خاص لتحقيق في الفئران بسبب مستوى إضافي من الاستقرار المطلوب. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن عدد من النهج، بما في ذلك دبابيس النخاعية مع المسامير المتشابكة، وتأمين لوحات والمثبتات الخارجية ^22. هذه الأنظمة تعمل بشكل جيد عموما، ولكن نظرا تصميم معقد من أنها يمكن أن يكون تحديا تقنيا لتثبيت. على سبيل المثال، جارسيا وآخرون. ²³ وضعت على المتشابكة نظام دبوس أنيق للاستخدام في الفئران، ولكن ينطوي على إجراء شقوق في اثنين الموقع مستقلالصورة وتعديل واسع من عظم الفخذ لاستيعاب الدبابيس. وأجريت هذه الإجراءات تحت المجهر تشريح.

هنا، نحن تصف دبوس النخاع الفخذ بسيط مع طوق المركزي تهدف إلى منع إغلاق عجز العظم 3 مم وكذلك ترسيم حواف الأصلية للعيب. في حين دبوس لم يحدد حتى العظم نفسه، وتحجيم دقيق لقطر دبوس والتوسيع من نتائج تجويف النخاع في التدخل كافية للحد من الحركة الالتوائية (الشكل 1). مع اختيار دقيق من العمر الفطرية ونوع الجنس والفئران المتطابقة سلالة، والنتيجة هي تكرار للغاية التصنع غير ^{uniondefect-22} التي يمكن تقييمها بسهولة شعاعيا. وعلاوة على ذلك المناطق ذات الاهتمام يمكن تعريف بتكاثر بعد التصوير المقطعي-حسابها الصغرى (μCT) لقياس دي نوفو تكوين العظام والمعلمات histomorphological. تم نموذج أولي من المسامير في مختبرنا باستخدام أدوات متوفرة بسهولة.

الشكل 1: مبدأ التجريبي ملخص بياني للنموذج الخلل القطعي. يتم استئصاله وسط شريحة 3 ملم من 9-10 ملم عظم الفخذ الفئران جراحيا (يسار). يتم تمرير 3 مم طويل، 19 مقياس أنابيب الصلب الجراحية أكثر من 9 ملم طويلة، 22 G أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ وثابتة بمادة لاصقة في وسط الدقيق (يمين). تم تجهيز دبوس الناتجة في القنوات النخاعية ما تبقى من أجزاء القريبة والبعيدة للعظم الفخذ مع G طوق 19 استبدال جزء 3 ملم من العظم (أدناه، وسط).

Protocol

ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لأنثى عارية (نيو / J) الفئران (18-25 غرام، 6 أسابيع) تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون. منذ سلالات من الفئران تختلف قليلا من حيث التشريح ومعدل النمو، ونحن ننصح أن تلفيق من الدبابيس هو الأمثل لسلالة ونوع الجنس والسن من المتلقين قبل الزرع في ال…

Representative Results

الفئران عادة استرداد وعيه والقائمة الخلفية التنقل 5-10 دقائق بعد انسحاب التخدير. خلال 5 أيام الأولى، فمن المستحسن لإيواء الفئران بشكل فردي وإدخال تخصيب البيئي لمنع استخدام الفائض من أطرافهم. لهذا الغرض، القباني من نوع أعشاش تقلل من الحاجة لبناء العش وتشجع يستريح. وقد ?…

Discussion

هنا، نحن تصف طريقة بسيطة لتوليد عيب الحرجة الحجم استقرت دبوس من عظم الفخذ الفئران باستخدام المختبر القياسية والمعدات البيطرية. في حين أن التجمع من المسامير وإجراء العمليات الجراحية في حد ذاته يتطلب الممارسة، فإنه على ما يرام في حدود قدرات عالم أبحاث الطب الحيوي الم?…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.