Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Estima-se que metade da população dos EUA experimentar uma fratura por 65 anos de idade ^1. Para aqueles pacientes com fraturas tratadas cirurgicamente, 500.000 procedimentos envolvem o uso de um enxerto ósseo ² e este número deverá aumentar com uma população cada vez mais envelhecida ³ . Embora o osso é um dos poucos órgãos que tem a capacidade de curar completamente sem formação de cicatrizes, existem casos em que o processo falha ^3,4. Dependendo das circunstâncias e qualidade do tratamento, 2-30% das fraturas de ossos longos falhar, resultando na não-união ^3,5. Embora ainda haja alguma debate para a definição, pseudo-artrose, lesões ósseas críticas porte ou não sindicalizados geralmente se refere a uma lesão que não cicatriza sobre a vida natural do sujeito ^6. Para fins experimentais, a sua duração for encurtado para o tempo médio necessário para a cura completa de uma lesão óssea de tamanho médio. Lesões ósseas não-sindicalizados ocorrer numerous razões, mas os principais fatores incluem trauma extremo resultando em uma lacuna crítica porte, infecção, má angiogênese, o uso do tabaco, ou a capacidade osteoregenerative inibido devido a doença ou ⁷ anos ^de idade. Mesmo se não uniões são tratados com sucesso, pode custar mais de US $ 60.000 por procedimento, dependendo do tipo de lesão e as abordagens empregadas ^8.

Nos casos moderados, enxerto ósseo autólogo é empregado. Esta estratégia envolve a recuperação do osso a partir de um local dador e o implante no local da lesão. Enquanto esta abordagem é extremamente eficaz, o volume disponível de osso derivadas de dador é limitada e o procedimento envolve uma cirurgia adicional, que resulta em dor persistente em muitos pacientes ^9,10. Além disso, a eficácia do enxerto ósseo autólogo é dependente da saúde do paciente. Substitutos ósseos feitos de materiais sintéticos ou de osso de doador falecido processados ​​estão disponíveis em abundância ^11-13, mas eles have limitações significativas, incluindo propriedades fraca adesão da célula hospedeira, reduzida osteocondutividade, e do potencial de rejeição imunológica ^14. Há, portanto, uma necessidade urgente de tecnologias de regeneração óssea que são seguros, eficazes e amplamente disponível.

A nossa capacidade de melhorar as estratégias de regeneração óssea é extremamente dependente da capacidade de imitar trauma ósseo grave em animais de laboratório, mas a geração e estabilização das lesões ósseas grandes é tecnicamente desafiador. Na maioria dos casos, o trauma grave ossos longos é mimetizado experimentalmente através da criação de um defeito que não irá naturalmente curar. Embora possa variar com as espécies ^{de 15,} isto é conseguido por remoção completa de um segmento de osso que é maior do que 1,5 vezes o diâmetro da secção transversal do osso ^16. O osso é então estabilizada com um implante de metal para manter a orientação adequada das arestas de fractura e para permitir a mobilidade. Devido ao seu pequeno tamanho e da fragilidade doseus ossos longos, o estabelecimento de tais lesões em camundongos estão além das capacidades da maioria dos grupos de pesquisa. Como tal, os modelos de defeitos dos ossos longos são confinadas a ratos e animais maiores. No entanto, os ratinhos proporcionam vantagens significativas de investigação em que eles podem ser modificados geneticamente e criadas estirpes como o sistema imunitário comprometido que não rejeitam as células e tecidos humanos.

Para aplicações baseadas em células humanas, os ratos imunocomprometidos são atraentes para trabalhar com eles, porque são fisiologicamente bem caracterizado, fácil de casa, de baixo custo e facilmente analisados ​​radiologicamente e histologicamente. De suma importância é que os ratos imunocomprometidos não rejeitam as células de diferentes espécies, incluindo os seres humanos. O seu pequeno tamanho também permite o teste de um pequeno número de células ou volumes de andaimes experimentais em aplicações ortopédicas. Vários modelos murinos ortopédicos têm sido relatado que proporcionam vários graus de estabilidade óssea ^17,18. Aqueles systems que resultam em níveis muito elevados de estabilidade, como fixadores externos e placas de bloqueio predominantemente curar por ossificação intramembranosa embora a cura endochondral tem sido relatada ^19. Em contraste, aqueles que permitem alguma micro e / ou macro-motion, como as que utilizam pinos medulares não corrigidos ou parcialmente fixos, geralmente curar com uma predominância de ossificação ^20,21. Retarde ou defeitos não sindicalizados de ossos longos são particularmente difíceis de alcançar em camundongos devido ao nível extra de estabilização necessária. No entanto, há relatos de um número de abordagens, incluindo pinos medulares com hastes bloqueadas, placas de bloqueio e fixadores externos ^22. Esses sistemas geralmente funcionam bem, mas dado o seu projeto complicado que pode ser tecnicamente desafiadora para instalar. Por exemplo, Garcia et al. ^23, concebeu um sistema de pino de bloqueio elegante para utilização em ratinhos, mas o procedimento envolve incisões em dois locais separadoss e extensa modificação do fémur para acomodar os pinos. Estes procedimentos foram realizados sob um microscópio de dissecação.

Descrevemos uma cavilha medular femoral simples, com uma gola central, concebido para impedir o fechamento de um défice de osso, 3 mm e também delinear as extremidades originais do defeito. Enquanto o pino não foi fixado ao próprio osso, dimensionamento preciso do diâmetro de pino e a fresagem dos resultados de cavidades medulares em interferência suficiente para minimizar o movimento de torção (Figura 1). Com cuidadosa seleção de idade inato, gênero e camundongos correspondida-deformação, o resultado é uma alta reprodutibilidade hipertrófica não-uniondefect ^22, que pode ser facilmente avaliada radiologicamente. Além disso regiões de interesse podem ser reprodutível definido após computadorizada de micro tomografia (μCT) para a medição de de formação de osso novo e parâmetros histomorfológicos. Os pinos foram protótipo em nosso laboratório usando ferramentas facilmente disponíveis.

Figura 1: princípio Experimental resumo esquemática do modelo de defeito segmentar.. O centro de segmento de 3 mm 9-10 mm de um fémur murino é excisado cirurgicamente (esquerda). Um, de calibre 19 de tubo de aço cirúrgico 3 milímetros de comprimento é passado sobre um 9, 22 mm de comprimento L do tubo de aço inoxidável e fixado com adesivo no centro exacto (à direita). O pino resultante é encaixada os canais medulares das restantes porções proximais e distais do fémur com a gola 19 G substituindo o segmento de 3 mm de osso (em baixo, ao centro).

Protocol

NOTA: Este protocolo é projetado para nu (Nu / J) camundongos fêmeas (18-25 g, 6 semanas) adquirido de Jackson Laboratories. Desde linhagens de camundongos variar um pouco em termos de anatomia e taxa de crescimento, aconselhamos que a fabricação de pinos é otimizado para a tensão, sexo e idade dos beneficiários antes da implantação em seres vivos. Se as estirpes são cuidadosamente combinados, o ajuste de interferência entre a cavilha e a cavidade da medula é altamente reprodutível. Procedimentos para a hab…

Representative Results

Ratos normalmente recuperar a consciência e traseiras-limb mobilidade 5-10 minutos após a retirada da anestesia. Durante os primeiros 5 dias, é aconselhável para abrigar os ratinhos individualmente e introduzir enriquecimento ambiental para evitar a utilização excessiva do membro. Para o efeito, do tipo iglu ninhos reduzir a necessidade de construção de ninhos e incentivar repouso. Observamos, também, que o fornecimento de alimentos e hidrogel no chão da gaiola reduz a probabilidade de pin deslocamento. Durant…

Discussion

Relata-se um método simples para gerar um defeito crítico porte estabilizado pinos do fêmur murino usando padrão de laboratório e equipamentos veterinários. Enquanto a montagem dos pinos e do próprio procedimento cirúrgico requer prática, é bem dentro das capacidades de um cientista de pesquisa biomédica bem treinado ou veterinário.

O pino é posicionado no canal medular, sem fixação adicional, tornando o procedimento tecnicamente mais viável do que as abordagens mais complica…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.