마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

그것은 치료 골절 환자의 경우 수술, 50 만 절차 골 이식 ^2의 사용을 포함한다. 미국 인구의 절반이 65 ^일의 나이 골절이 발생할 것으로 추정되며,이 숫자는 점점 고령화 ³ 증가 할 것으로 예상된다 . 뼈가 완전히 흉터없이 치유 능력을 갖는 몇몇 기관 중 하나이지만 프로세스 ^{3,4-을하지} 아니한 경우, 인스턴스가있다. 상황과 치료의 품질에 따라 긴 뼈 골절의 2-30% 비 노조 ^3,5의 결과로 실패합니다. 정의, 가관절, 크기의 중요한 또는 비 노조 뼈 부상에 대한 몇 가지 논쟁이 남아있는 동안 일반적으로 피사체 ^(6)의 자연 수명 기간 동안 치유되지 않는 상처를 의미한다. 실험 목적을 위해,이 기간은 평균 크기의 뼈 상해 완전히 치유에 필요한 평균 시간으로 단축된다. 비 노조 뼈의 병변은 NUM 발생erous 이유,하지만 주요 요인으로 인한 질병 또는 ⁷ 세에 비판적 크기의 차이, 감염, 가난한 혈관 신생, 흡연, 또는 억제 osteoregenerative 용량의 결과로 극단적 인 외상을 포함한다. 비 조합이 성공적으로 처리 된 경우에도, 그 손상의 유형 및 사용 방법 ^(8)에 따라, 프로 시저 당 60,000 달러를 초과하는 비용이있다.

적당한 경우, 자가골 이식술가 사용된다. 이 전략은 부상의 사이트에 공여 부위와 이식에서 뼈의 회복을 포함한다. 이 방법은 매우 효과적이지만, 가능한 도너 – 유도 된 뼈의 용적에 제한이 있으며 절차는 많은 환자에서 지속적인 통증 ^9,10 결과 추가적인 수술을 포함한다. 또한,자가 골 이식술의 효능, 환자의 건강 의존한다. 합성 물질 또는 처리 사체 뼈로 만든 뼈 대체는 ^11-13 풍부하게 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 하불량한 숙주 세포 접착 성이 감소 osteoconductivity 및 면역 거부 ^(14)에 대한 전위를 포함 상당한 제한을했습니다. 안전하고 효과적이고 널리 사용되어 골 재생 기술이 시급히 요구된다.

뼈 재생 전략을 개선하기 위해 우리의 능력을 시험 동물에 심각한 뼈 외상을 모방 할 수있는 능력에 결정적으로 의존하지만, 큰 뼈 병변의 생성 및 안정화 기술적 도전이다. 대부분의 경우, 심각한 긴 뼈 외상은 자연적으로 치유되지 않습니다 결함을 구축하여 실험적으로 모방한다. 그것은 ¹⁵ 종에 따라 다를 수 있지만, 이는 뼈의 단면 ^(16)의 1.5 배보다 큰 직경 뼈 세그먼트의 완전한 제거에 의해 달성된다. 뼈 골절 후 연부의 적절한 배향을 유지하고 이동을 허용하기 위해 금속 임플란트로 안정화된다. 때문에 작은 크기와의 취약성에긴 뼈, 마우스 등 병변의 설립은 대부분의 연구 그룹의 기능을 능가한다. 따라서, 긴 골 결손 모델 쥐와 큰 동물에 국한되어있다. 그럼에도 불구하고, 마우스들은 인간 유전자 변형 세포와 조직을 거부하지 않기 때문에 면역 타협 한 균주로 육종 할 수 있다는 점에서 상당한 이점을 연구 수득.

인간 세포 기반 응용 프로그램의 면역 손상 쥐들이 생리 학적으로 집에 쉽게, 잘 특성화 때문에 작업하기 매력, 비용 대비 효과, 쉽게 조직 학적, 방사선 학적 및 분석. 가장 중요한 면역 손상 마우스는 인간을 포함한 다른 종의 세포를 거부하지 않는다는 것입니다. 그들의 작은 크기도 세포 또는 응용 프로그램 정형 외과에서 실험 비계의 볼륨의 아주 작은 숫자의 테스트를 허용합니다. 몇몇 뮤린 모델은 정형 뼈 안정성 ^17,18 다양한 정도의 여유도보고되었다. 그 정기적 복용연골 치유가 ^19을보고 하였지만 이러한 외고정 고정판과 같은 매우 높은 안정성 수준을 초래할 MS 주로 intramembranous 골화 치유. 대조적으로, 이러한 비 고정 또는 부분적 수질 고정 핀을 이용하는 것과 같은 일부 마이크로 및 / 또는 매크로 움직임을 허용 자들은 일반적으로 ^{(20, 21)의} 연골 내 골화 우세 치료한다. 지연 유합 또는 긴 뼈의 불유합의 결함으로 인해 필요한 안정화의 추가 수준에 마우스를 달성하는 것이 특히 어렵다. 그러나 접근 방법은 연동 손톱 수질 핀, 잠금 판과 외고정 ^(22)를 포함하여,보고되었다. 이러한 시스템은 일반적으로 잘 작동하지만 그들의 복잡한 디자인들이 설치가 기술적으로 어려울 수 있습니다 주어. 예를 들어, 가르시아 등. ^(23)는 마우스에서 사용하기위한 우아한 연동 핀 시스템을 고안 있지만 절차는 두 개의 분리 된 부위에서 절개를 포함s와 대퇴골의 광범위한 수정은 핀을 수용 할 수 있습니다. 이러한 절차는 해부 현미경 하에서 수행 하였다.

여기서, 우리는 3mm 골 결손의 폐쇄를 방지하고 또한 결함의 원래 가장자리를 묘사하기위한 중앙 칼라와 간단한 대퇴 골수의 핀을 설명합니다. 핀 자체가 뼈에 고정되어 있지 않은 동안, 충분한 간섭 골수 공동 결과 핀 직경 리머의 정확한 크기는 비틀림 운동 (도 1)을 최소화한다. 근친 연령, 성별 및 유사한 변형 마우스의 신중한 선택으로, 방사선 학적 결과는 용이하게 평가할 수있다 재현성 비후성 비 uniondefect ^22이다. 또한 관심의 영역을 재현성 드 노보 골 형성 및 histomorphological 파라미터 측정 용 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 이후에 정의 될 수있다. 핀은 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여 우리의 실험실에서 프로토 타입했다.

그림 1 : 실험 원리 분절 결함 모델의 도식 요약.. 9-10mm 쥐의 대퇴골의 중심 3mm 세그먼트 (왼쪽) 수술로 절제한다. 3mm 길이, 19 게이지 수술 스틸 튜브는 정확한 센터 (오른쪽)에 길이 9mm, 22 G 스테인리스 스틸 관을 통해 전달 및 접착제로 고정되어 있습니다. 얻어진 핀 뼈 3mm 세그먼트 교체 19 G 칼라 (이하, 센터)과 대퇴골 근위부와 원위부 나머지 부분 운하 수질에 장착되어있다.

Protocol

참고 :이 프로토콜은 잭슨 연구소에서 획득 한 여성 누드 (민 / J) 마우스 (1,825 G, 6 주)을 위해 설계되었습니다. 쥐의 변종은 해부학과 성장 속도면에서 다소 차이가 있기 때문에, 우리는 핀의 제조 라이브 주제에 주입하기 전에 수신자의 변형, 성별과 연령에 최적화하는 것이 바람직합니다. 균주 신중 일치하는 경우, 핀 및 골수 공동 사이의 억지 끼워 맞춤은 높은 재현성이다. 주택, 다이어트 및 일…

Representative Results

마우스는 일반적으로 의식을 회복하고 뒷다리 이동성에게 마취의 철수 후 5 분에서 10 분. 처음 5 일 동안 개별적으로 마우스를 수용하고, 사지의 과​​도한 사용을 방지하기 위해 환경 농축을 소개하는 것이 좋습니다. 이 목적을 위해, 이글루 형 둥지 둥지 건물에 대한 필요성을 절감하고 휴식을 권장합니다. 우리는 또한 케이지의 바닥에 음식과 하이드로 겔의 조항이 핀 변위의 확률을 줄일 수 ?…

Discussion

여기서, 우리는 표준 실험실 및 수의 장비를 이용하여 쥐 대퇴골의 임계 크기 핀 – 안정화 된 결함을 생성하는 간단한 방법을 설명한다. 핀과 수술 자체의 조립은 연습이 필요하지만, 잘 잘 훈련 된 생물 의학 연구 과학자 또는 수의사의 기능에 있습니다.

핀은 외고정 또는 연동 나사를 사용 더 복잡한 방법보다 절차가 기술적으로 가능하고, 추가로 고정하지 않고 뼈 속질에 ?…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.